一种稳定的5’‑核糖核苷酸水解酶检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种稳定的5'‑核糖核苷酸水解酶(过氧化物酶法)检测试剂盒，属于临床体外诊断检测试剂技术领域。本发明专利技术试剂盒包括试剂R1和试剂R2。通过选择100 mmol/L pH为7.6的HEPES缓冲液，同时在试剂R2中选择稳定性好的肌苷酸二钠作为底物，且添加适量的D‑海藻糖、甘露醇、Triton X100和叠氮钠，提高了试剂盒的热稳定性，试剂的准确度和抗干扰性也较好。因此，本发明专利技术提供的5'‑核糖核苷酸水解酶(过氧化物酶法)检测试剂盒有利于在市场中进一步的推广使用。

A stable 5 'ribonucleotide hydrolase assay kit

The invention discloses a stable 5'ribonucleotide hydrolase (peroxidase method) detection kit, which belongs to the technical field of clinical in vitro diagnostic kit. The kit comprises reagent R1 and reagent R2. By selecting 100 mmol/L pH 7.6 HEPES buffer, at the same time in the selection of inosinic acid reagent R2 good stability two sodium as a substrate, and the added amount of D trehalose, mannitol, Triton X100 and sodium azide, improve the thermal stability of the reagent kit, accuracy and anti-interference also good. Therefore, the invention provides 5'ribonucleotide hydrolase (peroxidase method) detection kit in the market is conducive to further promote the use of.

【技术实现步骤摘要】
一种稳定的5’-核糖核苷酸水解酶检测试剂盒
本专利技术涉及临床体外诊断检测试剂
，特别涉及一种5'-核糖核苷酸水解酶检测试剂盒（过氧化物酶法）。
技术介绍
5'-核糖核苷酸水解酶（5'-Nucleoticlase,5'-NT）简称5'-核苷酸酶。5'-NT是一种对底物特异性不高的可作用于多种核苷酸的水解酶，能将次黄嘌呤核苷酸水解为次黄苷和磷酸。5'-NT广泛分布在人体和动物的组织中，例如肝、胆、胰、肠、心、脑、肺、肾、等脏器和组织中均有分布。5'-NT定位在细胞膜上，在肝内主要存在于胆小管和窦状间隙内。5'-NT在人体的运动、细胞生长发育、纤维蛋白合成、提高表皮或内皮屏障功能、神经传递及淋巴细胞的再循环及黏附、免疫应答等方面均发挥重要的作用。本专利技术的试剂盒用于检测人体血清或血浆中5'-核糖核苷酸水解酶（5'-NT）的活性，具有重要的临床意义。5'-NT活性增高常见于原发性和转移性肝癌、胆道癌、胰腺癌、胆道阻塞、胆管炎、急、慢性肝炎、肝硬化、药物性肝损伤，其活性增高可达2～6倍，且与病情严重程度呈正相关。5'-NT是诊断肝肿瘤非常灵敏的酶学指标。在病变早期，当肝功能、肝扫描和有关肝病检查阴性时本酶活性已明显增高。5'-NT经肝细胞膜进入胆汁，随之进入血清中，是检测肝胆疾病的指标之一。肝内外胆管堵塞和伴随循环转移的乳房切除术后的病人此酶升高明显。对于AFP阴性病例，其与AFP互补诊断肝癌的阳性率可达94％。ALP在肝胆系统疾病和骨骼系统疾病时均可增高。5'-NT除肝胆系统疾病增高外，骨骼系统疾病一般均不升高。因此5'-NT的检测能协助判断病人碱性磷酸酶（ALP）增高是由于肝胆系统疾病，还是骨髓系统疾病（如骨癌、骨肉瘤、佝偻病等）。5'-NT的检测也有助于鉴别诊断肝细胞性黄疸和阻塞性黄疸。5'-核糖核苷酸水解酶（5'-NT）的检测方法主要有化学发光法、钼蓝比色法、过氧化物酶法等。本专利技术属于过氧化物酶法，优化反应体系，选用pH7.6的HEPES缓冲液，选择稳定性更好的肌苷酸二钠为底物，并使用适量的D-海藻糖、甘露醇、TritonX100和叠氮钠为稳定剂，显著改善了检测试剂的热稳定性，专利技术了一种更稳定的5'-核糖核苷酸水解酶（过氧化物酶法）检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种稳定的用于检测血清或血浆中5'-核糖核苷酸水解酶（5'-NT）的试剂盒，该试剂盒采用过氧化物酶法。该试剂盒与常规的试剂盒相比，热稳定性和抗干扰性比常规的检测试剂盒要好，有利于保证试剂在夏季高温时节的长途运输中品质稳定，有利于在临床上的推广应用。基本原理：次黄嘌呤核苷酸(又名肌苷酸)在5'-核糖核苷酸水解酶（5'-NT）的催化下生成次黄苷和磷酸，次黄苷和磷酸在核苷酸磷酸化酶（PNP）作用下生成次黄嘌呤，次黄嘌呤在黄嘌呤氧化镁作用下氧化生成尿酸和过氧化氢，过氧化氢和TBHBA、4-AA在过氧化氢酶作用下生成红色醌类物质（Trinder's反应）。本专利技术是通过以下步骤得到的：试剂R1组成为：HEPES缓冲液，pH7.6100mmol/Lβ-甘油磷酸钠85mmol/L氯化镁53.4mmol/LEDTA-Na212mmol/L氯化钠100mmol/L亚铁氰化钾0.01mmol/LTBHBA20mmol/L叠氮钠15mmol/L；试剂R2组成为：HEPES缓冲液，pH7.6100mmol/L4-氨基安替比林6mmol/L肌苷酸二纳6.8mmol/LPNP4.5kU/LXOD7.5kU/LPOD30kU/LD-海藻糖5g/L甘露醇5%TritonX1001%叠氮钠15mmol/L。所述的5'-核糖核苷酸水解酶检测试剂盒，试剂R1、R2均为100mmol/LpH7.6的HEPES缓冲液。所述的5'-核糖核苷酸水解酶检测试剂盒，其特征在于试剂R1含有镁离子激活剂，且有EDTA调节其浓度平衡。所述的5'-核糖核苷酸水解酶检测试剂盒，其特征在于试剂R2选择较为稳定的肌苷酸二钠作为底物。所述的5'-核糖核苷酸水解酶检测试剂盒，其特征在于试剂R2使用适量的D-海藻糖、甘露醇、TritonX100和叠氮钠来提高试剂的热稳定性。所述的5'-核糖核苷酸水解酶检测试剂盒，其特征在于使用全自动生化分析仪采用速率法进行测定，检测主波长为546nm，副波长为800nm。本专利技术的试剂盒在具有双试剂功能的全自动生化分析仪上进行，其具体使用方法如下：加入生理盐水、样本或校准品5μl，再加入180μl的R1试剂预孵育5min，加入90μl的R2试剂，延迟3min后读取吸光度A1，再反应2min后，读取吸光度A2，并计算ΔA/min。本专利技术的有益效果：1）试剂R1中含有镁离子作为5'-NT的激活剂，且有EDTA调节其浓度平衡，试剂的准确度良好；2）试剂R1和试剂R2采用稳定性较好且具有适宜缓冲范围的HEPES缓冲体系，改善了试剂的缓冲性能，可提供更为稳定的pH环境；3）试剂R2中选择更为稳定的肌苷酸二钠为底物，使用了适量的D-海藻糖、甘露醇、TritonX100和叠氮钠，因此试剂的热稳定性好，且不会对试剂的准确度产生影响，有利于保证试剂在夏季高温时节的长途运输中品质稳定；4）试剂的抗干扰能力良好，成本也低，有利于该试剂在市场中进一步的推广。附图说明图1为两种试剂的相关性曲线图；图2为本试剂盒具体使用方法；图3为实施例1试剂与市场认可的5'-核糖核苷酸水解酶检测试剂盒对比检测结果；图4为实施例试剂抗干扰性能比较；图5为实施例1试剂热稳定性验证实验检测结果。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步说明。实施例1一种稳定的5'-核糖核苷酸水解酶（过氧化物酶法）检测试剂盒，它包括试剂R1和试剂R2；其中试剂R1组成为：pH7.6HEPES缓冲液100mmol/Lβ-甘油磷酸钠85mmol/L氯化镁53.4mmol/LEDTA-Na212mmol/L氯化钠100mmol/L亚铁氰化钾0.01mmol/LTBHBA20mmol/L叠氮钠15mmol/L；试剂R2组成为：pH7.6HEPES缓冲液100mmol/L4-氨基安替比林6mmol/L肌苷酸二纳6.8mmol/LD-海藻糖5g/L甘露醇5%TritonX1000.3%叠氮钠15mmol/LPNP4.5kU/LXOD7.5kU/LPOD30kU/L。本实施例所述试剂R1和试剂R2，配制时需先加入缓冲物质HEPES，用氢氧化钠调到适当pH值后，再加入其它物质，各种酶类最后加入。本实施例所述试剂盒，在使用时，其测定方法是采用具有双试剂功能的日立7180全自动生化分析仪，利用速率法进行测定，检测主波长为546nm，副波长为800nm。操作如下：加入生理盐水、样本或校准品5μl，再加入180μl的R1试剂预孵育5min，加入90μl的R2试剂，延迟3min后读取吸光度A1，再反应2min后，读取吸光度A2，并计算ΔA/min。ΔA/min＝（A2-A1）/反应时间5'-核糖核苷酸水解酶含量（U/L）＝（∆A/min测定÷∆A/min标准）×C标准测定：检测样本∆A/min标准：标准品。实施例2准确度验证试验：将实施例1的5'-核糖核苷酸水解酶检测试剂作为实验组，市场上获得认可的一种准确度好、稳定性好的5'-核糖核苷酸水解本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种稳定的5’‑核糖核苷酸水解酶（过氧化物酶法）检测试剂盒，其特征在于，包括体积比为2：1的试剂R1和试剂R2，其组分和含量分别如下：试剂R1：HEPES缓冲液，pH 7.6                  100mmol/Lβ‑甘油磷酸钠                        85mmol/L氯化镁                              53.4mmol/LEDTA‑Na2                            12mmol/L氯化钠                              100mmol/L亚铁氰化钾                          0.01mmol/LTBHBA                               20mmol/L叠氮钠                              15mmol/L；试剂R2：HEPES缓冲液，pH 7.6                  100mmol/L4‑氨基安替比林                      6mmol/L肌苷酸二纳                          6.8mmol/LPNP                                 4.5kU/LXOD                                 7.5kU/LPOD                                 30kU/LD‑海藻糖                            5g/L甘露醇                              5%Triton X100                         1%叠氮钠                              15mmol/L。...

【技术特征摘要】
1.一种稳定的5’-核糖核苷酸水解酶（过氧化物酶法）检测试剂盒，其特征在于，包括体积比为2：1的试剂R1和试剂R2，其组分和含量分别如下：试剂R1：HEPES缓冲液，pH7.6100mmol/Lβ-甘油磷酸钠85mmol/L氯化镁53.4mmol/LEDTA-Na212mmol/L氯化钠100mmol/L亚铁氰化钾...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋慧玲，王美丽，罗维晓，
申请(专利权)人：山东博科生物产业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37