纤维二糖水解酶变体和编码它们的多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及纤维二糖水解酶变体。本发明专利技术还涉及编码这些变体的多核苷酸；包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】纤维二糖水解酶变体和编码它们的多核苷酸 对序列表的引用 本申请包括一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。 专利技术背景 专利
本专利技术涉及纤维二糖水解酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方 法以及使用这些变体的方法。 相关技术说明 纤维素是单糖葡萄糖通过β -1，4-键共价连接的一种聚合物。许多微生物产生水 解β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。 内切葡聚糖酶在任意位置消化纤维素聚合物，使其打开而被纤维二糖水解酶攻击。纤维二 糖水解酶从纤维素聚合物的末端顺序地释放纤维二糖分子。纤维二糖是葡萄糖的一种水溶 性β -1，4-连接二聚体。β -葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。 将木质纤维素原料转化成乙醇具有如下优点，即易于获得大量原料、避免燃烧或 填埋材料的期望性、以及乙醇燃料的清洁性。现在认为木材、农业残余物、草本作物、和城市 固体废物是生产乙醇的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将木质 纤维素转化成可发酵糖（例如，葡萄糖），那么这些可发酵糖就容易地被酵母发酵成乙醇。 WO 2011/050037披露了具有纤维二糖水解酶活性和改进的热稳定性的土生梭孢 霉纤维二糖水解酶变体。WO 2011/050037披露了具有纤维二糖水解酶活性和改进的热稳定 性的烟曲霉纤维二糖水解酶变体。WO 2005/028636披露了红褐肉座菌Cel7A纤维二糖水解 酶I的变体。WO 2005/001065披露了灰腐质霉Cel7A纤维二糖水解酶I、红褐肉座菌纤维 二糖水解酶I和嗜热革节孢（Scytalidium thermophilium)纤维二糖水解酶I的变体。WO 2004/016760披露了红褐肉座菌Cel7A纤维二糖水解酶I的变体。美国专利号7, 375, 197 披露了里氏木霉纤维二糖水解酶I的变体。 本领域需要具有改进的特性的纤维二糖水解酶变体以增加木质纤维素原料的糖 化效率。 本专利技术提供了具有增加的比活性的纤维二糖水解酶变体。 专利技术概述 本专利技术涉及分离的纤维二糖水解酶变体，这些变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟 多肽的位置38的位置处包括取代，其中这些变体具有纤维二糖水解酶活性。 本专利技术还涉及编码这些变体的分离的多核苷酸；包括这些多核苷酸的核酸构建 体、表达载体和重组宿主细胞；以及产生这些变体的方法。 本专利技术还涉及用于降解或转化纤维素材料的方法，该方法包括：在本专利技术的纤维 二糖水解酶变体的存在下，用一种酶组合物处理该纤维素材料。在一个方面中，这些方法进 一步包括回收该降解的或转化的纤维素材料。 本专利技术还涉及产生发酵产物的方法，这些方法包括：(a)在本专利技术的纤维二糖水 解酶变体的存在下，用一种酶组合物糖化一种纤维素材料；(b)用一种或多种（例如，若干 种）发酵微生物发酵该糖化的纤维素材料，以产生该发酵产物；并且（C)从发酵中回收该发 酵产物。 本专利技术还涉及发酵纤维素材料的方法，这些方法包括：用一种或多种（例如，数 种）发酵微生物发酵该纤维素材料，其中在本专利技术的纤维二糖水解酶变体的存在下用一种 酶组合物使该纤维素材料糖化。在一个方面，发酵纤维素材料产生发酵产物。在另一个方 面中，这些方法进一步包括从发酵中回收该发酵产物。 附图简要说明 图1示出了在pH 5和25°C下5小时后，通过里氏木霉野生型纤维二糖水解酶I及 其W38A纤维二糖水解酶变体从微晶纤维素产生糖。将结果针对在对照样品中确定的背景 糖加以校正。 图2示出了在pH 5和25°C下5小时后，通过里氏木霉野生型纤维二糖水解酶I及 其W38A纤维二糖水解酶变体从预处理的玉米秸杆（PCS)产生糖。将结果针对在对照样品 中确定的背景糖加以校正。 定义 乙酰木聚糖酯酶：术语"乙酰木聚糖酯酶"意指一种羧酸酯酶（EC 3. 1.1. 72)，其 催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、α -萘基乙酸酯以及对硝基苯基乙 酸酯的水解。出于本专利技术的目的，在含有0.01% TWEEN?20(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂 酸酯）的50mM乙酸钠 （pH 5. 0)中使用0. 5mM乙酸对硝基苯酯作为底物来测定乙酰木聚糖 酯酶活性。将一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为在pH 5、25°C下每分钟能够释放1微摩尔 对硝基酚根阴离子的酶的量。 等位基因变体：术语"等位基因变体"意指占据同一染色体基因座的基因的两种或 更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多 态性。基因突变可以是沉默的（在所编码的多肽中没有改变）或可编码具有改变的氨基酸 序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。 a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶：术语" a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶"意指一种a -L-阿拉 伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶（EC 3. 2. 1. 55)，其催化a -L-阿拉伯糖苷中的末端非还原 性a-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对a-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有（1，3)_和/或 (1，5)_键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿 拉伯呋喃糖苷酶还被称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、a-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿 拉伯呋喃糖苷酶、多糖a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯 糖苷酶、或a-L-阿拉伯聚糖酶。出于本专利技术的目的，使用每ml的IOOmM乙酸钠 （pH 5) 中5mg的中等粘度小麦阿拉伯糖基木聚糖（麦格酶国际爱尔兰股份有限公司（Megazyme International Ireland, Ltd.)，爱尔兰威克洛郡布瑞公司（Bray, Co. Wicklow, Ireland)以 总体积200 μ 1在40°C下持续30分钟，接着通过AMINEX? HPX-87H柱色谱（伯乐实验 室有限公司（Bio-Rad Laboratories, Inc.)，赫拉克勒斯，加州，美国）进行阿拉伯糖分析 来测定a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。 α-葡糖醛酸糖苷酶：术语"α-葡糖醛酸糖苷酶"是指可催化a-D-葡萄 糖苷酸水解成为D-葡萄糖醛酸酯和醇的一种a-D-葡萄糖苷酸葡萄糖醛酸水解酶 (EC 3. 2. 1.139)。出于本专利技术的目的，根据德弗里斯（de Vries)，1998,细菌学杂志 (J.Bacteriol. ) 180:243-249来测定α-葡糖醛酸糖苷酶活性。一个单位的α-葡糖醛酸 糖苷酶等于能够在pH 5、40°C下每分钟释放1微摩尔的葡糖醛酸或4-0-甲基葡糖醛酸的酶 的量。 β -葡糖苷酶：术语" β -葡糖苷酶"意指一种β -D-葡糖苷葡糖水解酶 (E.C. 3. 2. 1.21)，其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄 糖。出于本专利技术的目的，根据文丘里（Venturi)等人，2002,基础微生物学杂志（J. Basic Microbiol. )42:55-66的程序使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物来测定 β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25°C、pH 4.8下，在含有0.01% TWEEN? 20的50mM本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纤维二糖水解酶变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置38的位置处包括取代，其中该变体具有纤维二糖水解酶活性并且其中该变体与亲本纤维二糖水解酶的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％序列一致性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·韦斯特，J·卡里，J·奥尔森，K·博克，K·延森，K·B·R·M·克罗，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK