使用激酶的新型测定方法及组合物技术

一种对激酶的正反应底物、其磷酸化物以及用于衍生为前述物质的衍生前体物中的至少一种进行测定的测定方法，该方法包括下述工序：使至少激酶、激酶的第一核苷酸辅酶以及与第一核苷酸辅酶的核苷部分不同的第二核苷酸辅酶与试样接触，使酶循环反应进行反应的工序；对于与第一核苷酸辅酶及其转化物以及第二核苷酸辅酶及其转化物中的至少任一种的变化量相对应的信号进行检测的工序；以及基于检测出的信号的变化量计算出试样所含有的激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的量的工序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用激酶的新型测定方法及组合物
本专利技术涉及使用激酶的基于酶循环法的新型高灵敏度测定方法及其组合物。
技术介绍
酶循环法是利用酶的作用增加极微量的物质的浓度来进行测定的方法。以往，作为辅酶的测定方法，已知有使用两种脱氢酶的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)循环法等辅酶的高灵敏度测定法(例如，参见非专利文献1)。另外，还有人报告了同样使用两种激酶来测定腺苷3磷酸(ATP)的循环法(例如，参见专利文献1)。另一方面，作为对不是辅酶的底物进行测定的酶循环法，可以举出使用两种转移酶进行测定的方法、以及利用一种酶进行测定的方法等。作为使用两种酶的方法，可以举出使用转氨酶和多胺氧化酶的方法(例如参见专利文献2)。该方法是通过使用腐胺转氨酶和多胺氧化酶的酶循环反应(从腐胺到4-氨基丁醛方向的反应使用多胺氧化酶、反方向的反应使用腐胺转氨酶)对腐胺进行定量的方法，具体地说，将由多胺氧化酶反应生成的过氧化氢通过已知的显色法进行测定。同样地，有人报告了使用苄胺转氨酶和苄胺氧化酶的苄胺类的测定方法、以及使用苄胺转氨酶和酪胺氧化酶的酪胺的测定方法(例如参见专利文献3、4)。另外，作为基于使用一种酶的循环法的测定方法，已知有使用脱氢酶的方法(例如参见专利文献5、6)。该方法是在氧化型辅酶NAD(P)或其类似物以及还原型辅酶NAD(P)或其类似物的存在下利用脱氢酶的可逆反应性进行酶循环反应，高灵敏度地对脱氢酶的底物进行定量的方法，其被用于在硫代NAD和还原型NAD的存在下使用3α-羟基类固醇脱氢酶进行的胆汁酸定量、使用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶进行的葡萄糖-6-磷酸定量等中。以往，作为以底物为测定对象的使用激酶的测定方法，例如已知有对甘油三脂进行测定的方法等(例如参见非专利文献2)。另外已知有对肌酐进行测定的方法(例如参见专利文献7)。该测定法为下述方法：将肌酐在肌酐酰氨基水解酶的作用下转换为肌酸，进一步在ATP的存在下利用肌酸激酶转换为肌酸磷酸和腺苷2磷酸(ADP)，之后测定该ADP，从而对肌酐进行测定。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2006-223163号公报专利文献2：日本特开平3-180200号公报专利文献3：日本特开平7-155199号公报专利文献4：日本特开平7-177898号公报专利文献5：日本特开平3-224498号公报专利文献6：日本特开平4-335898号公报专利文献7：日本特开平9-285297号公报非专利文献非专利文献1：生化学実験講座5酵素研究法(上)(生化学实验讲座5酶研究法(上)),社团法人日本生化学会编辑,东京化学同人,1975年,P121-135非专利文献2：酵素－バイオテクノロジーへ的指針－日本農芸化学会編集(酶-面向生物技术的指南-日本农艺化学会编辑),朝仓出版,1985年,P97-101
技术实现思路
专利技术所要解决的课题本专利技术的课题在于提供能够高精度地对激酶正反应底物、其磷酸化物以及用于衍生为前述物质的衍生前体物中的至少一种进行测定的方法以及组合物。解决课题的手段在基于酶循环法的测定法中，由于基于酶反应的信号会随着所添加的酶量而增加，因而其是能够适用于通过控制酶量而进行高灵敏度定量的技术。特别是在对底物进行定量的酶循环法中，使用激酶的方法目前尚未为人所知，在对底物进行定量的酶循环法中的测定对象受到限制。另外，在激酶反应中，通常正反应比逆反应优先进行这一点是普遍的，在利用逆反应的酶循环法中应用激酶在技术上被认为是困难的。另一方面，如上所述，作为使用激酶的底物的测定方法，有使用肌酸激酶对肌酐进行测定的方法等(例如参见专利文献7)，但激酶只不过被用于向一个方向进行的化学计量转换反应，因此，在测定对象物的浓度低的情况下，不一定得到足够的灵敏度，需要通过增加被测物量等来进行应对。但是在增加被测物量时，容易受到共存物质的影响等，从实用性的方面考虑存在问题。在这样的情况下，本专利技术人发现，在激酶中，可催化激酶反应的正反应和逆反应这两个方向的反应、且在正反应和逆反应中利用具有不同核苷部分的辅酶的激酶具有多种，在将这些激酶用于酶循环反应中时，能够出人意料地以高灵敏度测定出激酶正反应底物和/或其磷酸化物或用于衍生为前述物质的衍生前体物，从而完成了本专利技术。本专利技术例如具有以下的构成。[1]一种测定方法，其是对激酶的正反应底物、其磷酸化物以及用于衍生为前述物质的衍生前体物中的至少一种进行测定的测定方法，该方法包括下述工序：(1)使激酶、激酶的第一核苷酸辅酶和与第一核苷酸辅酶的核苷部分不同的第二核苷酸辅酶与试样接触，使下式(1)的循环反应进行反应的工序，所述激酶在核苷酸辅酶的存在下催化由激酶的正反应底物生成其磷酸化物的正反应及其逆反应，且在正反应和逆反应中利用至少具有各不相同的核苷部分的核苷酸辅酶；在测定对象为衍生前体物的情况下，所述试样为进行了使衍生前体物定量地衍生为激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的处理而得到的试样；[化1](2)对信号的变化量进行检测的工序，所述信号的变化量对应于第一核苷酸辅酶、第一核苷酸辅酶的转化物、第二核苷酸辅酶以及第二核苷酸辅酶的转化物中的至少任一种的变化量；以及(3)基于检测出的信号的变化量，计算出试样所含有的激酶的正反应底物、其磷酸化物以及用于衍生为前述物质的衍生前体物中的至少一种的量的工序。[1-1]如上述[1]中所述的测定方法，其中，测定对象为激酶的正反应底物和/或其磷酸化物。[1-1-1]如上述[1]或[1-1]中所述的测定方法，其中，测定对象为激酶正反应底物和/或其磷酸化物，测定对象与激酶的组合为表1中记载的任一种组合。[表1]测定对象激酶肌酸和/或其磷酸化物肌酸激酶3-磷酸甘油酸和/或其磷酸化物3-磷酸甘油酸激酶丙酮酸和/或其磷酸化物丙酮酸激酶果糖-6-磷酸和/或其磷酸化物磷酸果糖-1-激酶甘油和/或其磷酸化物甘油激酶己糖和/或其磷酸化物己糖激酶葡萄糖和/或其磷酸化物ADP依赖性葡萄糖激酶[1-1-2]如上述[1]至[1-1-1]中任一项所述的测定方法，其中，测定对象为激酶正反应底物和/或其磷酸化物，测定对象与激酶的组合为下述任一种组合。另外，在下文中，按照测定对象：激酶的顺序来记载。另外，其磷酸化物是与所记载的激酶正反应底物相对应的磷酸化物。肌酸/其磷酸化物：肌酸激酶(EC2.7.3.2)3-磷酸甘油酸/其磷酸化物：3-磷酸甘油酸激酶(EC2.7.2.3)丙酮酸/其磷酸化物：丙酮酸激酶(EC2.7.1.40)果糖-6-磷酸/其磷酸化物：磷酸果糖-1-激酶(EC2.7.1.11)甘油/其磷酸化物：甘油激酶(EC2.7.1.30)己糖/其磷酸化物：己糖激酶(EC2.7.1.1)葡萄糖/其磷酸化物：ADP依赖性葡萄糖激酶(EC1.7.1.147)[1-2]如上述[1]中所述的测定方法，其中，测定对象为衍生前体物，试样为进行了使衍生前体物定量地衍生为激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的处理而得到的试样；基于检测出的信号的变化量，计算出衍生前体物的量。[1-2-1]如上述[1]或[1-2]中所述的测定方法，其中，测定对象为衍生前体物，测定对象、激酶、以及激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的组合为表2中记载的任一种组合。[表2][1-2-2]如上述[1]、[1-2]和[1-2-1]中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定方法，其是对激酶的正反应底物、其磷酸化物以及用于衍生为前述物质的衍生前体物中的至少一种进行测定的测定方法，该方法包括下述工序：(1)使激酶、所述激酶的第一核苷酸辅酶和与所述第一核苷酸辅酶的核苷部分不同的第二核苷酸辅酶与试样接触，使下式(1)的循环反应进行反应的工序，所述激酶在核苷酸辅酶的存在下催化由激酶的正反应底物生成其磷酸化物的正反应及其逆反应，且在所述正反应和所述逆反应中利用至少具有各不相同的核苷部分的核苷酸辅酶；在测定对象为衍生前体物的情况下，所述试样为进行了使所述衍生前体物定量地衍生为所述激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的处理而得到的试样；[化1]

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.26 JP 2014-1967201.一种测定方法，其是对激酶的正反应底物、其磷酸化物以及用于衍生为前述物质的衍生前体物中的至少一种进行测定的测定方法，该方法包括下述工序：(1)使激酶、所述激酶的第一核苷酸辅酶和与所述第一核苷酸辅酶的核苷部分不同的第二核苷酸辅酶与试样接触，使下式(1)的循环反应进行反应的工序，所述激酶在核苷酸辅酶的存在下催化由激酶的正反应底物生成其磷酸化物的正反应及其逆反应，且在所述正反应和所述逆反应中利用至少具有各不相同的核苷部分的核苷酸辅酶；在测定对象为衍生前体物的情况下，所述试样为进行了使所述衍生前体物定量地衍生为所述激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的处理而得到的试样；[化1](2)对信号的变化量进行检测的工序，所述信号的变化量对应于所述第一核苷酸辅酶、所述第一核苷酸辅酶的转化物、所述第二核苷酸辅酶以及所述第二核苷酸辅酶的转化物中的至少任一种的变化量；以及(3)基于所述检测出的信号的变化量，计算出所述试样所含有的激酶的正反应底物、其磷酸化物以及用于衍生为前述物质的衍生前体物中的至少一种的量的工序。2.如权利要求1所述的测定方法，其中，测定对象为所述激酶的正反应底物和/或其磷酸化物。3.如权利要求1或2所述的测定方法，其中，测定对象为所述激酶的正反应底物和/或其磷酸化物，所述测定对象与所述激酶的组合为表1中记载的任一种组合。[表1]测定对象激酶肌酸和/或其磷酸化物肌酸激酶3-磷酸甘油酸和/或其磷酸化物3-磷酸甘油酸激酶丙酮酸和/或其磷酸化物丙酮酸激酶果糖-6-磷酸和/或其磷酸化物磷酸果糖-1-激酶甘油和/或其磷酸化物甘油激酶己糖和/或其磷酸化物己糖激酶葡萄糖和/或其磷酸化物ADP依赖性葡萄糖激酶4.如权利要求1所述的测定方法，其中，测定对象为所述衍生前体物，所述试样为进行了使所述衍生前体物定量地衍生为所述激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的处理而得到的试样，基于所述检测出的信号的变化量，计算出所述衍生前体物的量。5.如权利要求1或4所述的测定方法，其中，测定对象为所述衍生前体物，所述测定对象、所述激酶以及所述激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的组合为表2中记载的任一种组合。[表2]6.如权利要求1、4和5中任一项所述的测定方法，其中，测定对象是作为所述衍生前体物的肌酐，所述激酶为肌酸激酶，所述激酶的正反应底物为肌酸。7.如权利要求1以及4至6中任一项所述的测定方法，其中，在使所述衍生前体物定量地衍生为所述激酶的正反应底物和/或其磷酸化物的处理中，包括以下步骤：在水的存在下使肌酐酰氨基水解酶(EC3.5.2.10)与肌酐接触。8.如权利要求1至7中任一项所述的测定方法，其中，所述第一核苷酸辅酶的核苷部分为腺苷、鸟苷、胸苷、尿苷、胞苷、黄苷黄苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧尿苷、脱氧胞苷、脱氧黄苷以及脱氧肌苷中的任一种。9.如权利要求1至7中任一项所述的测定方法，其中，所述第二核苷酸辅酶的核苷部分为腺苷、鸟苷、胸苷、尿苷、胞苷、黄苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧尿苷、脱氧胞苷、脱氧黄苷和脱氧肌苷中的任一种。10.如权利要求1至9中任一项所述的测定方法，其中，所述第一核苷酸辅酶的核苷部分与所述第二核苷酸辅酶的核苷部分的组合为：腺苷与肌苷、鸟苷与腺苷、脱氧腺苷与鸟苷、脱氧腺苷与脱氧鸟苷、脱氧腺苷与肌苷、或肌苷与腺苷。11.如权利要求1至10中任一项所述的测定方法，其中，所述第一核苷酸辅酶的核苷部分为腺苷，所述第二核苷酸辅酶的核苷部分为肌苷。12.如权利要求1至权利要求11中任一项所述的测定方法，其中，所述第一核苷酸辅酶为腺苷3磷酸(ATP)，所述第二核苷酸辅酶为肌苷2磷酸(IDP)。13.如权利要求1至12中任一项所述的测定方法，其中，在所述对信号的变化量进行检测的工序中，使用能够利用基于正反应的所述第一核苷酸辅酶的转化物但不能利用所述第二核苷酸辅酶的检测用酶、或者不能利用所述第一核苷酸辅酶但能够利用基于逆反应的所述第二核苷酸辅酶的转化物的检测用酶，对于与所述基于正反应的第一核苷酸辅酶的转化物或者所述基于逆反应的第二核苷酸辅酶的转化物的增加量相对应的所述信号的变化量进行检测。14.如权利要求1至13中任一项所述的测定方法，其中，在所述对信号的变化量进行检测的工序中，使用腺苷2磷酸(ADP)依赖性葡萄糖激酶(EC2.7.1.147)，在葡萄糖的存在下对于与腺苷2磷酸(ADP)的增加量相对应地变化的信号的变化量进行检测。15.如权利要求1至14中任一项所述的测定方法，其中，在所述对信号的变化量进行检测的工序中，使用腺苷2磷酸(ADP)依赖性葡萄糖激酶(EC2.7.1.147)，在硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(硫代NADP)、硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(硫代NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：植田成，酒瀬川信一，
申请(专利权)人：旭化成制药株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP