本发明专利技术公开了一组生物标志物的测定方法，包括以下步骤：（1）提取与净化；（2）标准工作溶液的配制；将空白样品按上述步骤（1）处理，用该空白样品基质溶液在 2～100 µg/L 范围内，配制至少三个浓度的生物标志物系列浓度标准工作液；（3）液相色谱- 串联质谱法（LC-MS/MS）测定。本发明专利技术利用分散固相萃取技术，建立了简便、快速并能有效避免样品中基质干扰的样品前处理方法，将此前处理方法结合HPLC-MS/MS 应用于动物组织及尿液中生物标志物的含量的定性确证和定量检测，方法回收率在74.2%～106.2%之间，平均相对标准偏差（RSD）为6.4%～13.0%，检出限为20.0 μg/kg, 定量限为50.0 μg/kg，具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一组生物标志物的测定方法，更具体地说是采用高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)定性定量测定生物组织或尿液品中的生物标志物含量的方法，属于生物标志物测定
技术介绍
近年来，随着溴氰菊酯使用范围的不断扩大，溴氰菊酯的毒理研究亦从单纯的选择低等生物为实验对象研究神经毒性作用机制，扩展到对哺乳动物的三致作用、代谢过程等多层次的研究。为评估其生态风险，需要发展用于生物亚致死效应的指示参数来更为准确地评估和预测其对环境生物的毒害情况许多研究者首先从生物化学方面探索反应污染物对生物早期的影响参数，其中生物标志物法因为测定指标全面、准确且系统，而得到普遍认可。生物标志物通常分为三类：即暴露标志物、效应标志物和易感性标志物。在选择合适的生物标志物时，有时需要综合分析，权衡利弊，采取一组综合的评价指标。溴氰菊酯，分子式C22H19Br2NO3，分子量505.20，结构式如下：因其在人体内代谢十分迅速，目前技术很难检测出尿中的原型；1R,3R-二溴菊酸[(1R-cis)-3-(2,2-dibromoethenyl)-2,2-dimethylcyclopropane carboxylic acid]和3-苯氧基苯甲酸(3-phenoxybenzoic acid，3-PBA)是溴氰菊酯分子的两个组成部分，3-苯氧基苯甲酸是多种菊酯农药相同的代谢产物，同时检测1R,3R-二溴菊酸与3-苯氧基苯甲酸可能成为溴氰菊酯特异性的代谢标志物。国内研究通过观察小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率与精母细胞染色体崎变率等发现溴氰菊酯具有致突变性，国外研究结果也表明：溴氰菊酯具有致癌、致畸与致突变性。溴氰菊酯的毒作用研究多集中于神经毒性、免疫毒性、肝脏毒性与内分泌毒性等，但近年来，其对DNA的毒作用已经引起了学者们的广泛关注；中毒体征、常规理化、传统DNA形态学分析方法已不能满足在分子水平进行研究的需要，检测技术上推陈出新日显迫切。在溴氰菊酯的毒作用机理中，活性氧损伤机制受到众多学者的认可。活性氧在生物体内可以造成多种DNA氧化性损伤，形成多种形式的碱基加合物、碱基丢失、DNA断裂或交联等DNA生物标志物，这些损伤引起DNA功能的抑制和结构的改变，从而使DNA中遗传信息的稳定性受到不同程度的破坏。活性氧攻击DNA可形成二十几种修饰碱基，其中8-羟基脱氧鸟苷化学性质稳定，被认为是反映DNA氧化损伤灵敏和稳定的指标之一，可以作为内源及外源因素对DNA氧化损伤的生物标志物，当基因组中出现高含量的8-羟基脱氧鸟苷时，特异性糖基酶完全修复DNA损伤的能力丧失；8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)是活性氧自由基氧化细胞核DNA或线粒体DNA后形成的产物。作为较理想的DNA氧化损伤作用的生物标志物，8-OH-dG引起了生态毒理学和生物医学界的广泛兴趣。另外，烷化损伤是DNA损伤的另一种方式，在DNA中最易被烷化的是鸟嘌呤，鸟嘌呤氧6位甲基化，形成6-甲氧基鸟嘌呤。6-甲氧基鸟嘌呤则是烷基化学物诱导产生重要的DNA突变前损伤产物，如不能及时修复，则有致癌性的危险。单胺类神经递质含量变化是反映颅内神经代谢的较敏感指标，单胺类递质包括儿茶酚胺和吲哚胺两类。儿茶酚胺类主要有肾上腺素(EP)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)及其产物，吲哚类主要指5-羟基色胺(5-HT)。5-羟基色胺(5-HT)是一种重要的神经递质和信号分子，5-HT在中枢及外周神经系统中都发挥重要作用。在中枢神经系统，5-HT能影响人的睡眠、情绪、行为、认知等；在外周，5-HT能调节血管收缩与舒张、胃肠蠕动、细胞增殖及凋亡、血小板聚集等。有研究表明，有关污染物暴露实验动物实验中，发现较多的污染物可作用于哺乳动物的神经系统，并表现为兴奋性神经毒性，并可影响包括5-HT在内的单胺类神经递质及其代谢产物的水平。5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)是由5-HT在单胺氧化酶(MAO)作用下转化而来的。人及动物体液中5-HIAA含量的测定对于对多种疾病的诊断、治疗及机理研究有重要价值，有研究表明转移性癌症患者尿中5-HIAA显著增高。另外5-HIAA作为5-HT的主要代谢产物，对其排泄量的测定可以反映体内5-HT的量，因此两者的含量或者其含量比均可作为重要的生物标志物，对类癌、精神-神经性疾病、消化系统粘膜损伤、肝功能损伤以及由于污染物暴露评估或生态毒理导致的以上疾病的诊断、评估具有重要价值。对于生物标志物的检测目前大多采用针对单一组分，不同检测技术，分别检测的模式，不利于污染物暴露评估需要多指标综合评估的需求。本专利技术根据溴氰菊酯对动物染毒暴露后可能形成的多种生物标志物，结合溴氰菊酯的特异性代谢产物，采用液相色谱/串联质谱建立同时测定尿液和动物组(脑、肝等)包括1R,3R-二溴菊酸[(1R-cis)-3-(2,2-dibromoethenyl)-2,2-dimethylcyclopropane carboxylic acid]、3-苯氧基苯甲酸(3-phenoxybenzoic acid，3-PBA)、8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)、6-甲氧基鸟嘌呤、5-羟基色胺(5-HT)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、多巴胺、肾上腺素、3-硝基丙酸、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、维生素C等组合生物标志物的检测方法。为溴氰菊酯食品安全以及环境毒理学暴露评估提供简便、快速、准确的检测技术。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种同时测定尿液和动物组(脑、肝等)包括1R,3R-二溴菊酸[(1R-cis)-3-(2,2-dibromoethenyl)-2,2-dimethylcyclopropane carboxylic acid]、3-苯氧基苯甲酸(3-phenoxybenzoic acid，3-PBA)、8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)、6-甲氧基鸟嘌呤、5-羟基色胺(5-HT)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、多巴胺、肾上腺素、3-硝基丙酸、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、维生素C等组合生物标志物的检测方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：(1)前处理提取与净化动物肉、动物肉样品经均质制样机充分粉碎(-20℃避光保存)；动物尿样品冰箱中(-20℃避光保存)，样品使用前避光解冻。a)动物肉样品：称取样品(2.00±0.01)g，加基质分散固相萃取剂研磨至色泽均一，转移至50mL聚丙烯离心管中，准确加入10mL提取液和10μL抗氧剂溶液，涡旋10s后用细胞破碎仪超声提取5min。8000r/min离心5min，将上本文档来自技高网...
【技术保护点】
一组生物标志物的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取与净化样品制备动物肉、动物肝样品经均质制样机充分粉碎，‑20℃避光保存；动物尿样品冰箱中‑20℃避光保存，样品使用前避光解冻：a)动物肉样品：称取样品2.00±0.01g，加基质分散固相萃取剂研磨至色泽均一，转移至50mL聚丙烯离心管中，准确加入10mL提取液和10μL抗氧剂溶液，涡旋10s后用细胞破碎仪超声提取5min，8000r/min离心5min，将上清液转移至另一洁净聚丙烯离心管中；残渣加入5mL提取液，重复提取一次，合并上清液，将合并后的上清液4℃10000r/min离心5min，所得上清液于40℃下氮气吹至近干；用乙腈水(1:9)定容至1mL，定溶液涡旋后转移至2mLEP管中，4℃12000r/min离心10min，吸取上层清液至棕色进样小瓶，HPLC‑MS/MS分析；b)肝脏样品：称取样品2.00±0.01g，加基质分散固相萃取剂研磨至色泽均一，转移至50mL聚丙烯离心管中，准确加入10mL提取液和10μL抗氧剂溶液，涡旋10s后用细胞破碎仪超声提取5min，8000r/min离心5min，将上清液转移至另一洁净聚丙烯离心管中；残渣加入5mL提取液，重复提取一次，合并上清液，将合并后的上清液4℃10000r/min离心5min，所得上清液于40℃下氮气浓缩至2mL左右，加入5×2mL乙腈饱和正己烷脱脂2次，离心，将弃去正己烷后的提取液继续40℃下氮气浓缩至近干；用乙腈：水(1:9)定容至1mL，涡旋后转移至2mL EP管中，4℃12000r/min离心10min，吸取上层清液至棕色进样小瓶，HPLC‑MS/MS进样分析；c)尿液样品：用移液枪取1.0mL动物尿样品于50mL聚丙烯离心管中，用甲酸铵缓冲液调节至中性，加入10μL抗氧剂和1mL甲醇，涡旋30s后8000r/min离心5min，转出上清液，加5mL正己烷脱脂2次后，加载至事先用甲醇和水活化好的HLB小柱，接取流出样液，4℃12000r/min离心10min，吸取上清液进棕色进样小瓶，HPLC‑MS/MS分析；(2)标准工作溶液的配制将空白样品按上述步骤(1)处理，用该空白样品基质溶液在2～100μg/L范围内，配制至少三个浓度的生物标志物系列浓度标准工作液；(3)液相色谱‑串联质谱法(LC‑MS/MS)测定将步骤(2)中的各浓度梯度的标准工作液进行LC‑MS/MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤(1)中净化后的样品液注入LC‑MS/MS进行测定，测得样品液中生物标志物的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中生物标志物含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中生物标志物含量。...
【技术特征摘要】
1.一组生物标志物的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取与净化
样品制备动物肉、动物肝样品经均质制样机充分粉碎，-20℃避光保存；动物尿样品冰
箱中-20℃避光保存，样品使用前避光解冻：
a)动物肉样品：称取样品2.00±0.01g，加基质分散固相萃取剂研磨至色泽均一，转移至50
mL聚丙烯离心管中，准确加入10mL提取液和10μL抗氧剂溶液，涡旋10s后用细胞破碎仪超
声提取5min，8000r/min离心5min，将上清液转移至另一洁净聚丙烯离心管中；残渣加入
5mL提取液，重复提取一次，合并上清液，将合并后的上清液4℃10000r/min离心5min，
所得上清液于40℃下氮气吹至近干；用乙腈水(1:9)定容至1mL，定溶液涡旋后转移至2mL
EP管中，4℃12000r/min离心10min，吸取上层清液至棕色进样小瓶，HPLC-MS/MS分析；
b)肝脏样品：称取样品2.00±0.01g，加基质分散固相萃取剂研磨至色泽均一，转移至50mL
聚丙烯离心管中，准确加入10mL提取液和10μL抗氧剂溶液，涡旋10s后用细胞破碎仪超声提
取5min，8000r/min离心5min，将上清液转移至另一洁净聚丙烯离心管中；残渣加入5mL
提取液，重复提取一次，合并上清液，将合并后的上清液4℃10000r/min离心5min，所得
上清液于40℃下氮气浓缩至2mL左右，加入5×2mL乙腈饱和正己烷脱脂2次，离心，将弃
去正己烷后的提取液继续40℃下氮气浓缩至近干；用乙腈：水(1:9)定容至1mL，涡旋后转
移至2mL EP管中，4℃12000r/min离心10min，吸取上层清液至棕色进样小瓶，HPLC-MS
/MS进样分析；
c)尿液样品：用移液枪取1.0mL动物尿样品于50mL聚丙烯离心管中，用甲酸铵缓冲
液调节至中性，加入10μL抗氧剂和1mL甲醇，涡旋30s后8000r/min离心5min，转出上清
液，加5mL正己烷脱脂2次后，加载至事先用甲醇和水活化好的HLB小柱，接取流出样液，4℃
12000r/min离心10min，吸取上清液进棕色进样小瓶，HPLC-MS/MS分析；
(2)标准工作溶液的配制
将空白样品按上述步骤(1)处理，用该空白样品基质溶液在2～100μg/L范围内，配
制至少三个浓度的生物标志物系列浓度标准工作液；
(3)液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定
将步骤(2)中的各浓度梯度的标准工作液进行LC-MS/MS测定，以标准工作液的色谱
峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤(1)中净化后
的样品液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中生物标志物的色谱峰面积，代入标准曲线，
得到样品液中生物标...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹文卿，静平，李建军，林黎明，杨桂朋，封立平，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：山东;37
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