干燥形态的酶反应试剂及其制备方法技术

本发明专利技术提供在反应时不需要在体系中补充成分、可以在室温下稳定地保存的干燥形态的含铵盐的酶反应试剂。通过使用Good’s缓冲剂，抑制了铵盐来源的缓冲剂在干燥时的pH变化。

Enzyme reaction reagent for dry form and its preparation method

The present invention provides an enzyme reaction reagent which does not need to supplement components in the system and can be kept stable at room temperature in a dry form containing ammonium salts. By using the Good 's buffer, the pH change of the buffer of ammonium salt in drying was inhibited.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】干燥形态的酶反应试剂及其制备方法
本专利技术涉及蛋白的保存方法及用于该保存方法的试剂。
技术介绍
近年来开发了利用酶反应的高特异性的各种检查方法或诊断方法，其一部分作为制品在社会中普及。一般来说，酶反应由于是由缓冲液或金属盐、基质、辅酶等构成的复杂组成，因此在检查或诊断时对反应溶液进行用时制备是复杂的操作。因而，为了简化反应溶液的制备，有预先将反应所需的试剂类进行混合的方法。液状形态的预混试剂可以仅添加检体进行使用、简便性高。但是，酶在稀释溶液的状态下长期保存时，多有发生失活的情况，在低温下的保质期为1年左右。另一方面，干燥形态的预混试剂虽然在使用时需要进行溶解，但由于可以任意地选择溶解液的种类、分量，因而用途扩展的范围较广。另外，轻量、易于运输，在常温下能够长期地稳定地保存。酶反应中充分已知的反应之一是利用聚合酶进行序列特异性的核酸合成反应。以PCR为代表的核酸扩增法利用该反应，不仅限于学术研究的情况，在基因检查等中也被充分使用。基因检查试剂中，有仅通过添加检体、反应即可开始者，为干燥试剂时，还存在可在室温下长期稳定地保存者。在核酸扩增反应中，为了使反应最佳化，含有铵盐者并不少。例如，作为等温扩增法的LAMP法或SmartAmp法中使用的BstDNA聚合酶或AacDNA聚合酶等一般来说在反应溶液中含有硫酸铵(非专利文献1、2)。但是，很早就已知当对这种含有铵盐的试剂进行冷冻干燥时，即便是刚干燥后，再溶解的反应溶液的酶活性也会显著降低。对于该问题，提出了以不使酶和缓冲剂或其成分与铵盐进行接触、或者不以高浓度使它们接触的状态进行冷冻干燥，在反应时进行混合的方法(专利文献1)。但是，由于有制品形态受到限制的可能，因而还没有在反应前不需预先进行分离的干燥形态的含铵盐的酶反应试剂。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2006-129727号公报非专利文献非专利文献1：Notomiet.al.，NucleicAcidsRes.，28，2000，e63非专利文献2：Mitaniet.al.，Nat.Methods，4，2007，257-262
技术实现思路
专利技术所要解决的课题本专利技术的课题在于解决上述现有技术的问题，提供在反应时不需要在体系中补充成分，在室温下也可稳定地保存的干燥形态的含铵盐的酶反应试剂。用于解决课题的手段本专利技术者们为了解决上述课题反复进行了深入研究，结果发现，通过使用Good’s缓冲剂，可以抑制对含铵盐的试剂进行干燥、进行再溶解时所发生的酶活性的降低，进而专利技术了本方法及本试剂。即，本专利技术包含以下构成。(1)Good’s缓冲剂在用于抑制至少由缓冲剂、铵盐及酶构成的生化学反应试剂在干燥时的酶活性降低的用途。(2)一种干燥试剂组合物的制造方法，其包含以下工序：a)含有超过2.5mM浓度的Good’s缓冲剂、铵盐、干燥保护剂及核酸扩增酶的试剂溶液的制备工序；b)a)中制备的试剂溶液的干燥工序。(3)上述(2)所述的制造方法，其特征在于，所述Good’s缓冲剂的浓度为5mM以上。(4)上述(2)或(3)所述的制造方法，其中，所述Good’s缓冲剂为BES、Bicine、CHES、DIPSO、EPPS、HEPES、HEPPSO、MOPS、POPSO、TAPS、TAPSO、TES及Tricine中的至少1个。(5)上述(2)～(4)中任一项所述的制造方法，其中，所述Good’s缓冲剂为BES、Bicine、HEPES、HEPPSO、POPSO及Tricine中的至少1个。(6)上述(2)～(5)中任一项所述的制造方法，其中，所述Good’s缓冲剂为Bicine或Tricine。(7)上述(2)～(6)中任一项所述的制造方法，其中，所述铵盐为硫酸铵。(8)上述(2)～(7)中任一项所述的制造方法，其中，所述干燥保护剂为糖类、表面活性剂、水溶性聚合物、蛋白中的至少1个。(9)一种核酸扩增反应用干燥试剂组合物，其是通过上述(2)～(8)中任一项所述的制造方法获得的。本说明书包含作为本申请优先权基础的日本专利申请号2015-095535号的公开内容。专利技术效果通过本专利技术，可以提供在反应时不需要在体系中补充成分，在室温下也可稳定地保存的干燥形态的含铵盐的酶反应试剂。具体实施方式本专利技术中的Good’s缓冲剂在缓冲剂中特别是指含有分子内具有两性离子结构的化合物的缓冲剂，作为其特征性性质，可举出化学稳定、酸解离平衡(aciddissociationequilibrium)难以受到离子组成的影响或者与金属离子的络合物形成能力小等，但只要是显示与它们同样性质的物质，则无限定。本专利技术中的Good’s缓冲剂优选为BES(N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonicacid))、Bicine(N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸(N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycine))、CHES(N-环己基-2-氨基乙磺酸(N-Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonicacid))、DIPSO(3-[N,N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸((3-[N,N-Bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-hydroxy-1-propanesulfonicacid))、EPPS(3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(3-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]propanesulfonicacid))、HEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪]乙磺酸(2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonicacid))、HEPPSO(2-羟基-3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(2-Hydroxy-3-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]propanesulfonicacid))、MOPS(3-吗啉代丙磺酸(3-Morpholinopropanesulfonicacid))、POPSO(哌嗪-1,4-二(2-羟基-3-丙磺酸)(Piperazine-1，4-bis(2-hydroxy-3-propanesulfonicacid))、TAPS(N-三(羟甲基)甲基-3-胺基丙磺酸(N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonicacid))、TAPSO(2-羟基-N-三(羟甲基)甲基-3-胺基丙磺酸(2-Hydroxy-N-tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonicacid))、TES(N-三(羟甲基)甲基-2-胺基-乙磺酸(N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonicacid))及Tricine(N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸)N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycine))中的至少1个，更优选为BES、Bicine、HEPES、HEPPSO、POPSO及Tricine中的至少1个，进一步优选为B本文档来自技高网...

【技术保护点】
Good’s缓冲剂在用于抑制至少由缓冲剂、铵盐及酶构成的生化学反应试剂在干燥时的酶活性降低中的用途。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.08 JP 2015-0955351.Good’s缓冲剂在用于抑制至少由缓冲剂、铵盐及酶构成的生化学反应试剂在干燥时的酶活性降低中的用途。2.一种干燥试剂组合物的制造方法，其包含以下工序：a)含有超过2.5mM浓度的Good’s缓冲剂、铵盐、干燥保护剂及核酸扩增酶的试剂溶液的制备工序；b)a)中制备的试剂溶液的干燥工序。3.根据权利要求2所述的制造方法，其特征在于，所述Good’s缓冲剂的浓度为5mM以上。4.根据权利要求2或3所述的制造方法，其中，所述Good’s缓冲剂为BES、Bicine、CHES、DIPSO、EPPS、HEPES、HEPPSO、M...

【专利技术属性】
技术研发人员：栂达也，宫本重彦，田中穂积，
申请(专利权)人：株式会社钟化，
类型：发明
国别省市：日本,JP