一种人类尿液DNA的提取试剂盒及提取方法技术

本发明专利技术提供了一种人类尿液DNA的提取试剂盒，包括1）前处理剂；2）DNA提取液Ⅱ；3）DNA提取液D；4）DNA溶解液；5）无水乙醇和75%乙醇。本发明专利技术还提供了一种人类尿液DNA的提取试剂盒。本发明专利技术具有如下技术效果：本发明专利技术有较高的重复稳定性，不需要重复试验，在50例志愿者尿液DNA提取中，仅一次提取即得高质量的模板DNA，在对全外显子的扩增中，所有提取的尿液DNA模板均能成功进行扩增，得到与预计片段大小相同的产物，测序结果也证实了本发明专利技术的可靠性。

【技术实现步骤摘要】
一种人类尿液DNA的提取试剂盒及提取方法
本专利技术属于生物
，涉及自非损伤性取样材料中提取DNA的方法，具体涉及一种人类尿液DNA的提取试剂盒及提取方法。
技术介绍
膀胱癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤，约95％来源于膀胱上皮。其中膀胱尿路上皮癌是泌尿道的恶性肿瘤。癌发病率水平在全国32个肿瘤登记处的合计为6.69/10万，占全部恶性肿瘤新发病例的2.52％。按性别统计，膀胱癌男、女发病率分别为10.10/10万和3.20/10万，男性是女性的3.16倍。膀胱癌死亡率水平在全国32个肿瘤登记中为2.53/10万，占全部恶性肿瘤死亡总数的1.47％。膀胱癌在全球发病率位列第五。在大多数情况下，约75％的患者处于Ta或T1期，即非肌肉浸润膀胱癌(non-muscleinvasivebladdercancer,NMIBC)，而剩下的25％肿瘤处于肌肉入侵阶段T2-T4癌症(muscleinvasivebladdercancer,MIBC)。目前用于膀胱癌预防复发的药物疗效并不理想。高达40％-80％的患者会发生一次或多次复发，10％-15％的患者会发展为更高级别的肿瘤或发生转移。由于高复发率和恶化的风险，早诊断，早治疗，频繁的长期监测对于膀胱癌患者提高生存率十分重要。传统的膀胱癌检查是膀胱镜检查和细胞学活检，但膀胱镜检查属于有创检查，费用高且会给患者带来一定痛苦，其结果可能会收操作者主观判断而带来一定的误差。而细胞学活检则存在灵敏度低的缺陷(34％左右)。因此无创检测，高灵敏度特异性是未来膀胱癌检测和监控手段发展的方向。近年来，基因诊断在人类多种肿瘤、疾病的早期诊断、治疗以及预后评估中受到广泛重视。进行基因诊断的首要工作室样品的采集和DNA样本的提取。过去采样的方法主要有两种：一是伤害性取样，即获取病人的病理组织和血液等组织样本，这种方法会对病人造成疼痛；二是非伤害性取样，即通过获取病人的毛发、指甲等分析样品，虽然该方法不会对病人造成疼痛，但是从这些样品中抽取的DNA含量太少，很难用来进行分子诊断。非损伤性取样时在不触及或者不伤害人体本身的情况下，通过收集人的毛发、粪便、尿液、食物残渣等不同形式的分析样品而进行DNA的提取和分析。在非损伤性取样材料中，尿液是一种理想的分析样品，原因包括：(1)人类排尿具有节律性，相对于其他非损伤性取样材料来说，样品充足，易于采集；(2)尿液样品可以在不接触样品来源人的情况下直接获取，对人的干扰小；(3)采集尿液样本可以显著降低采样花费成本。因此，该方法排除了传统对病人取样方法的种种不利因素，近年来已经被广泛关注。
技术实现思路
为了实现膀胱癌的早期发现，早期干预，本专利技术的目的在于提供一种新的操作简便、成本低廉的提取尿液中细胞DNA的提取试剂盒及提取方法。本专利技术的人类尿液DNA的提取试剂盒，包括：1)前处理剂；2)DNA提取液Ⅱ；3)DNA提取液D；4)DNA溶解液；5)无水乙醇和75％乙醇；所述的前处理剂为PEG6000；所述的DNA提取液Ⅱ的组分及各组分在DNA提取液Ⅱ中的含量如下：异硫氰酸胍2mol/L，EDTA20mmol/L，二硫苏糖醇32.5mmol/L，Tris-HCl10mmol/L，TritonX-1004％v/v；所述的DNA提取液D的组分及浓度如下：盐酸胍4mol/L；所述的DNA溶解液的组分及浓度如下：Tris-HCL10mM。使用所述的试剂盒用于人类尿液DNA的提取方法，包括前处理和DNA提取，具体步骤如下：A、前处理：1)取尿液分装至离心管中，加入PEG6000至每个离心管中，涡旋震荡直至其完全溶解；2)离心，去上清，剩2ml液体；3)充分重悬剩余液体并将其转移至离心管中，往其中加入PBS缓冲液，离心；4)离心结束后，弃去上清留1ml液体，往其中加入PBS缓冲液混匀，再转移至离心管中，离心；5)弃去上清，留200μL保留在离心管中，-20℃保存；B、DNA提取：1)根据尿液前处理后的体积，在样本中加入等体积的DNA提取液Ⅱ，吹打混匀，置于常温孵育10-15min充分裂解；2)孵育后加入DNA提取液D，颠倒混匀至液体呈均匀混浊状，得到细胞裂解液；3)向细胞裂解液加入无水乙醇，颠倒混匀至呈清亮透明后，转移全部液体至离心柱中，室温静置后，离心，倒弃滤液；4)往离心柱中加入75％乙醇，离心；5)重复第4步一次；6)将离心柱再离心以去除残留液体；7)取出离心柱放至另一洁净的离心管中，打开离心柱盖，室温放置3-5min挥发残留乙醇后，在柱中央加入56℃预热的DNA溶解液，室温放置3-5min；8)将离心管和收集管一起放进离心机离心，离心，收集DNA溶液于上述离心管中，丢弃离心柱；DNA溶液用于检测或-20℃保存备用。本专利技术与现有技术相比，有如下创新点：1)增加了前处理，前处理中我们加入了PEG6000，可以增加溶液的溶解度，提高溶液对其他杂质分子的溶解能力，从而在离心的时候更有利于沉淀尿液中的脱落细胞，尽可能避免引入其他杂质，为后续的DNA提取做准备。2)省略了蛋白酶K，在DNA的提取过程中，我们采用了含有盐酸胍成分的试剂来代替蛋白酶K，用于溶解蛋白质，破坏细胞结构，从而减少了DNA提取时间，同时也降低了成本费用。3)本专利技术得到的DNA片段，260/280比值介于1.7-1.9之间，可直接用于PCR和其他分子生物学用途。本专利技术具有如下技术效果：本专利技术有较高的重复稳定性，不需要重复试验，在50例志愿者尿液DNA提取中，仅一次提取即得高质量的模板DNA，在对全外显子的扩增中，所有提取的尿液DNA模板均能成功进行扩增，得到与预计片段大小相同的产物，测序结果也证实了本专利技术的可靠性。附图说明图1A为使用没有经过预处理的志愿者A1的人类尿液提取DNA后，利用Nanodrop分光光度计对提取DNA作浓度检测的结果。图1B为使用没有经过预处理的志愿者A2的人类尿液提取DNA后，利用Nanodrop分光光度计对提取DNA作浓度检测的结果。图2A为使用本专利技术提取方法提取志愿者B1的人类尿液DNA后，利用Nanodrop分光光度计对提取DNA作浓度检测的结果。图2B为使用本专利技术提取方法提取志愿者B2的人类尿液DNA后，利用Nanodrop分光光度计对提取DNA作浓度检测的结果。图3A为使用现有的尿液DNA提取试剂盒提取志愿者C1的人类尿液DNA后，利用Nanodrop分光光度计对提取DNA作浓度检测的结果。图3B为使用现有的尿液DNA提取试剂盒提取志愿者C2的人类尿液DNA后，利用Nanodrop分光光度计对提取DNA作浓度检测的结果。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。现以正常人尿液为例，非限定实施例叙述如下：实施例11、尿液样品采集：采集人体排出的暴露不超过24小时的晨尿样品，将尿液置于60mL采集尿液杯中。2、样品保存：采集后的尿液样品，4小时内置于室温存放，4小时以上置于4℃存放。3、样品前处理：处理步骤：将收集到的来自两位志本文档来自技高网...

【技术保护点】
人类尿液DNA的提取试剂盒，其特征在于，包括：1)前处理剂；2)DNA提取液Ⅱ；3)DNA提取液D；4)DNA溶解液；5)无水乙醇和75％乙醇；所述的前处理剂为PEG 6000；所述的DNA提取液Ⅱ的组分及各组分在DNA提取液Ⅱ中的含量如下：异硫氰酸胍2mol/L，EDTA 20mmol/L，二硫苏糖醇32.5mmol/L，Tris‑HCl 10mmol/L，TritonX‑100 4％v/v；所述的DNA提取液D的组分及浓度如下：盐酸胍4mol/L；所述的DNA溶解液的组分及浓度如下：Tris‑HCL 10mM。

【技术特征摘要】
1.人类尿液DNA的提取试剂盒，其特征在于，包括：1)前处理剂；2)DNA提取液Ⅱ；3)DNA提取液D；4)DNA溶解液；5)无水乙醇和75％乙醇；所述的前处理剂为PEG6000；所述的DNA提取液Ⅱ的组分及各组分在DNA提取液Ⅱ中的含量如下：异硫氰酸胍2mol/L，EDTA20mmol/L，二硫苏糖醇32.5mmol/L，Tris-HCl10mmol/L，TritonX-1004％v/v；所述的DNA提取液D的组分及浓度如下：盐酸胍4mol/L；所述的DNA溶解液的组分及浓度如下：Tris-HCL10mM。2.使用如权利要求1所述的试剂盒用于人类尿液DNA的提取方法，其特征在于，包括前处理和DNA提取，具体步骤如下：A、前处理：1)取尿液分装至离心管中，加入PEG6000至每个离心管中，涡旋震荡直至其完全溶解；2)离心，去上清，剩2ml液体；3)充分重悬剩余液体并将其转移至离心管中，往其中加入PBS缓冲液，离...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明，陆颖锶，杨俊，黄曦，韩丽娜，何金津，周进生，丘远辉，
申请(专利权)人：泰州达安达瑞医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32