一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法技术

本发明专利技术提供一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法，包括液氮研磨；trizol裂解；取中间红色透明裂解液去除脂肪层；氯仿萃取；异丙醇沉淀；75%乙醇溶液两次洗涤；滤纸干燥等步骤。本发明专利技术通过增加单位体积trizol的牛脂肪组织裂解量和延长裂解时间，明显的提高了RNA产量；裂解后加入氯仿前离心，可以避免脂类对后续步骤的干扰；沉淀RNA时，调低离心加速度，可以有效的将RNA沉淀收集至底部；滤纸呈扇形，便于深入离心管中快速吸干液体，加速RNA干燥，以提高RNA的复融效率和纯化效果。总之，本发明专利技术克服了脂肪组织干扰物质多，单位质量RNA含量低的缺点，显著提高了脂肪组织提取RNA的产量，且纯度好，操作简单。

A method for extracting total RNA from bovine fat tissue

The invention provides a method for extracting total RNA from bovine adipose tissue, including liquid nitrogen grinding, Trizol cracking, removing fat layer with intermediate red transparent lysate, chloroform extraction, isopropanol precipitation, 75% ethanol solution two times washing, filter paper drying and other steps. The present invention by increasing the amount of cleavage of bovine adipose tissue volume Trizol and prolong the cracking time, significantly improve the yield of RNA; cracking after adding chloroform before centrifugation, can avoid the interference of lipids in the following steps; the precipitation of RNA, reduce the centrifugal acceleration, can effectively the RNA precipitate was collected to the bottom; a fan-shaped filter, easy to deep in the centrifuge tube fast dry liquid, accelerate RNA drying, so as to increase the RNA melting efficiency and purification effect. In conclusion, the invention overcomes many shortcomings of fat tissue interfering substances and low unit mass RNA content, significantly improves the yield of RNA extracted from adipose tissue, and has good purity and simple operation.

【技术实现步骤摘要】
一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法
本专利技术涉及分子生物
，具体涉及一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法。
技术介绍
随着社会经济的发展，脂肪组织的生理代谢愈来愈受到人们的重视，其原因包括以下两个方面：1.从人类健康角度来看，肥胖，糖尿病，心脑血管疾病等人类代谢疾病与脂肪组织关系密切；2.从人类的消费角度来看，脂肪在肌肉中的沉积是影响肉品质的重要因素，其与肉的嫩度，肌内脂肪含量成正相关，直接决定着肉的口感与风味。脂肪的沉积与分解由基因决定，了解脂肪组织的基因表达情况对我们解析脂肪的代谢机制至关重要。而脂肪组织RNA的提取则是进行以上研究最为关键的一步。目前，RNA提取技术已经较为成熟，但是，当组织RNA丰度极低，干扰物质较多时，按照常规步骤操作，往往不能取得理想的结果。而脂肪组织的特殊性就在于其脂类物质丰富（成熟细胞包含一个大的中央脂滴），总RNA量极低（单位体积细胞数少，单位细胞RNA含量也相对较少），这都是脂肪组织总RNA较难提取的原因所在。市场上虽有商业化的试剂盒，但其价格昂贵，针对性不强。因此，针对脂肪组织寻求一种费用低，且高效稳定的总RNA提取方法，显得尤为迫切。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种产量大、纯度高的从牛脂肪组织中提取总RNA的方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法，包括以下步骤：步骤1：取牛脂肪组织，在液氮环境中研磨至粉末状，迅速转移至预冷的离心管中；步骤2：向步骤1的离心管中加入trizol，使用振荡器振荡5～20分钟，然后裂解1小时，得裂解液，离心，去除上层脂肪层与底部不溶物，取中间红色透明裂解液；步骤3：在步骤2所得中间红色透明裂解液中，缓慢加入氯仿，手动振荡混匀，于冰上静置5～20min，然后离心，取透明上清液；步骤4：在步骤3所得透明上清液中，缓慢加入预冷的异丙醇，于冰上静置5～20min，然后离心，弃上清液，得底部沉淀；步骤5：在步骤4所得底部沉淀中，加入体积分数为75%的乙醇溶液，轻微振荡，使底部沉淀悬浮，离心，弃上清液，得第一次底部沉淀，再次加入体积分数为75%的乙醇溶液，轻微振荡，使底部沉淀悬浮，离心，弃上清液，得第二次底部沉淀；步骤6：取步骤5所得第二次底部沉淀，使用滤纸吸干离心管内的液体，干燥7～10min，然后加入DEPC处理水溶解。进一步地，所述研磨时间为7～13min。进一步地，步骤2中所述裂解1小时过程中振荡离心管。进一步地，步骤1所述的牛脂肪组织的质量和步骤2所述的trizol的体积比为0.1～0.3:1～1.3。进一步地，步骤2～步骤5所述的离心的转速均为12000r/min，离心的时间为10～15min，离心温度为4℃。进一步地，步骤3所述中间红色透明裂解液与氯仿的体积比为3～4:1，冰上静置时上下颠倒使分层消失。进一步地，步骤4所述透明上清液与异丙醇的体积比为1:1～1.3。进一步地，所述滤纸呈圆心角度为5～20°的扇形。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法，提高了脂肪组织提取RNA的产量和纯度，且操作简单，经济实惠；本专利技术增加了单位体积trizol的牛脂肪组织裂解量，同时延长了裂解时间，其目的是为了充分释放组织中的RNA；裂解后，加入氯仿前进行离心，是为了去除牛脂肪组织中的脂类及细胞碎片，以减少其对后续步骤的影响；加入异丙醇后，将离心机加速度调至最低，可以很好的将RNA沉淀收集在离心管的底部，避免RNA不能沉淀到底部或者直接沉淀至离心管壁上；体积分数为75%的乙醇溶液洗涤两次，可以更为彻底的除去脂肪组织中的水溶性杂质；滤纸呈圆心角度为5～20°的扇形，便于深入离心管中快速吸干液体，加速RNA干燥，以提高RNA的复融效率和纯化效果。附图说明图1是本专利技术一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法实施例1中步骤2裂解离心后的效果图；图2是本专利技术一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法实施例1中三组所制备的RNA溶液的琼脂糖电泳图；图3是本专利技术一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法实施例1中第一组提取的总RNA为模板反转录得到cDNA进行DGAT2基因检测的琼脂糖电泳图；图4是本专利技术一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法实施例1中第一组提取的总RNA进行进行5RACE实验的琼脂糖电泳图。附图中标号为：1为脂肪层，2为红色透明裂解液，3为底部不溶物。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步说明：实施例1一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法，包括以下步骤：步骤1：取牛脂肪组织，在液氮环境中研磨至粉末状，研磨时间为10min，迅速转移至预冷的1.5mL的离心管中；步骤2：向步骤1的离心管中加入1.3mL的trizol，使用振荡器振荡10分钟，然后裂解1小时，得裂解液，离心10min，离心的转速为12000r/min，离心的温度为4℃，清楚可见上层的白色脂肪，去除上层脂肪层与底部不溶物，取中间红色透明裂解液，中间红色透明裂解液约1.1mL；步骤3：在步骤2所得中间红色透明液体，缓慢加入300μL氯仿，手动振荡混匀，于冰上静置10min，静置时上下颠倒使分层消失，然后离心15min，离心的转速为12000r/min，离心的温度为4℃，取透明上清液，透明上清液约600μL；步骤4：在步骤3所得透明上清液中，缓慢加入700μL预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀絮状沉淀，于冰上静置15min，然后离心，离心机采用eppendorf公司的centrifuge5810R型号的离心机，将离心机的加速度调节至最低档（1档），即使离心机缓慢加速至转速为12000r/min，然后离心15min，离心的温度为4℃，弃上清液，得底部沉淀；步骤5：在步骤4所得底部沉淀中，加入1.2mL的体积分数为75%的乙醇溶液，轻微振荡，使底部沉淀悬浮，离心15min，离心的转速为12000r/min，离心的温度为4℃，弃上清液，得第一次底部沉淀，再次加入1.2mL的体积分数为75%的乙醇溶液，轻微振荡，使底部沉淀悬浮，离心15min，离心的转速为12000r/min，离心的温度为4℃，弃上清液，得第二次底部沉淀；步骤6：取步骤5所得第二次底部沉淀，使用圆心角度为10°的扇形滤纸吸干离心管内的液体，避免接触第二次底部沉淀，干燥10min，然后加入50微升的DEPC处理水溶解，溶解过程中使用20微升量程的移液器轻轻吹打加速溶解。按照上述制备方法设置为三组，三组的制备步骤均相同，不同之处在于步骤1中所取牛脂肪组织的质量不同，第一组：牛脂肪组织的质量为0.3g，第二组：牛脂肪组织的质量为0.2g，第三组：牛脂肪组织的质量为0.1g。三组所制备的溶解溶液，分别采用nanodropone和琼脂糖电泳检测RNA纯度与浓度，结果见表1和图2。表1其中，表1中数值为均数±标准差；从表1中可以看出，根据本专利技术所述RNA提取方法，牛脂肪组织的质量为0.3g提取的总RNA的浓度明显大于牛脂肪组织的质量为0.2g或0.1g提取的总RNA的浓度。且三组数据A260/A280的比值均在1.90以上，表明本专利技术提取总RNA中无蛋白、DNA等物质的污染；A260/A230的比值均在2.10以上，表明本专利技术提取总RNA中无苯酚，盐类等有机物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：取牛脂肪组织，在液氮环境中研磨至粉末状，迅速转移至预冷的离心管中；步骤2：向步骤1的离心管中加入trizol，使用振荡器振荡5～20分钟，然后裂解1小时，得裂解液，离心，去除上层脂肪层与底部不溶物，取中间红色透明裂解液；步骤3：在步骤2所得中间红色透明裂解液中，缓慢加入氯仿，手动振荡混匀，于冰上静置5～20min，然后离心，取透明上清液；步骤4：在步骤3所得透明上清液中，缓慢加入预冷的异丙醇，于冰上静置5～20min，然后离心，弃上清液，得底部沉淀；步骤5：在步骤4所得底部沉淀中，加入体积分数为75%的乙醇溶液，轻微振荡，使底部沉淀悬浮，离心，弃上清液，得第一次底部沉淀，再次加入体积分数为75%的乙醇溶液，轻微振荡，使底部沉淀悬浮，离心，弃上清液，得第二次底部沉淀；步骤6：取步骤5所得第二次底部沉淀，使用滤纸吸干离心管内的液体，干燥7～10min，然后加入DEPC处理水溶解。

【技术特征摘要】
1.一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：取牛脂肪组织，在液氮环境中研磨至粉末状，迅速转移至预冷的离心管中；步骤2：向步骤1的离心管中加入trizol，使用振荡器振荡5～20分钟，然后裂解1小时，得裂解液，离心，去除上层脂肪层与底部不溶物，取中间红色透明裂解液；步骤3：在步骤2所得中间红色透明裂解液中，缓慢加入氯仿，手动振荡混匀，于冰上静置5～20min，然后离心，取透明上清液；步骤4：在步骤3所得透明上清液中，缓慢加入预冷的异丙醇，于冰上静置5～20min，然后离心，弃上清液，得底部沉淀；步骤5：在步骤4所得底部沉淀中，加入体积分数为75%的乙醇溶液，轻微振荡，使底部沉淀悬浮，离心，弃上清液，得第一次底部沉淀，再次加入体积分数为75%的乙醇溶液，轻微振荡，使底部沉淀悬浮，离心，弃上清液，得第二次底部沉淀；步骤6：取步骤5所得第二次底部沉淀，使用滤纸吸干离心管内的液体，干燥7～10min，然后加入DEPC处理水溶解。2.根据权利要求1所述的一种从牛脂肪组织中提取总...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝瑞杰，李敏，程恺雯，马云，孙宁，汪书哲，郑秋枝，
申请(专利权)人：信阳师范学院，
类型：发明
国别省市：河南,41