本发明专利技术公开了一种建立非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型的方法。该方法选择高脂饲料喂养C3H/HeN小鼠12周，观察小鼠体重、肝重、转氨酶、糖脂代谢指标及肝脏组织学变化，建立非酒精性脂肪性肝病小鼠。再选择10PFU量的鼠肝炎3型病毒(MHV-3)感染小鼠，观察受感染后小鼠的存活率、肝脏组织学及肝内病毒复制，从而建立类似人类疾病过程的非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型。该模型的建立为系统研究非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎的病毒动力学、免疫学改变和防治措施提供了有力的工具。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学研究领域，涉及一种动物模型的构建方法，特别涉及一种用 于模拟、研究和防治非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎的小鼠模型的构建方法。
技术介绍
非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是代谢综 合征在肝脏的表现，包括单纯性脂肪肝（simple steatosis),脂肪性肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis，NASH),以及NASH相关的肝纤维化/肝硬化、肝癌。随着生活水平的提 高，NAFLD在发展中国家的发病率显著上升，我国NAFLD发病率在过去的10年增加了近一 倍，部分地区的发病率已达四分之一。我国是肝炎病毒感染的高发地区，约有1亿乙型肝炎 病毒（Hepatitis B virus, HBV)感染者及 4000 万丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV) 感染者，其中合并NAFLD的患者有逐年增加的趋势，NAFLD合并病毒性肝炎是我国面临的一 个新的健康问题。目前，关于NAFLD对病毒性肝炎的病毒动力学、免疫学及肝脏损伤影响机 制仍不明确。 对于NAFLD合并病毒性肝炎的人群研究存在很多难点。首先，研究中多用肝脏超 声诊断脂肪肝。肝脏超声检查仅能检出肝内脂肪沉积超过30%的中度脂肪肝，难以检出轻 度脂肪肝（肝脏内脂肪沉积为5% -30% )，因此在分组时，可能将轻度脂肪肝患者作为无脂 肪肝的对照。其次，在研究NAFLD合并慢性乙型肝炎（Chronic h印atitis B，CHB)时，难以 保证受试者在代谢、病毒、治疗等多种因素上的一致性。第三，人群研究难以获取肝组织观 察肝内免疫、代谢等方面的改变。建立可以模拟人类NAFLD合并病毒性肝炎疾病特点的动 物模型，可以克服上述临床研究中的不足。 相关的模型建立方法极少，中国科技大学傅苗苗在2009年发表的硕士研究生 学位论文《乙肝病毒转基因小鼠对营养性脂肪肝炎更敏感》中，曾采用胆碱蛋氨酸缺乏 (Methionine-Choline_Deficient，MCD)饮食喂养转有乙肝表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBsAg)的转基因小鼠，建立NASH合并HBsAg表达的小鼠模型。但该模型与非酒精 性脂肪性肝病合并病毒性肝炎患者的临床特点仍存在些许不同。第一，该小鼠模型仅转入 了含有编码HBsAg的基因片段，并不是完整的病毒基因，在体内不能形成完整的病毒颗粒， 不能模拟病毒复制情况；第二，该模型为转基因小鼠，小鼠免疫系统对转入的基因片段所表 达的HBsAg产生耐受，不能产生抗病毒免疫应答；第三，MCD饮食诱导的小鼠模型，只是在肝 脏病理上具有和非酒精性脂肪性肝炎一致的特征，但是模型小鼠会出现体重降低，外周胰 岛素敏感，甚至出现低血糖，与临床患者的代谢情况相反。范建高等（Fatty liver reduces hepatitis B virus replication in a genotype B hepatitis B virus transgenic mice model，Journal of gastroenterology and hepatology，27(2012) 1858 - 1864)使用高脂饮 食喂养HBV转基因小鼠，构建了具有非酒精性脂肪性肝病及HBV病毒表达的小鼠模型。该 动物模型较傅苗苗建立的小鼠模型更接近临床病人表现，但是无法克服转基因小鼠所共有 的缺陷。第一，转基因小鼠对HBV病毒耐受，小鼠免疫系统对HBV病毒不会产生免疫应答， 不能进行免疫学方面的研究；第二，转基因小鼠虽然可以复制并释放HBV颗粒，但是HBV病 毒本身并不能感染小鼠肝细胞，不能模拟病毒感染及复制的完整周期。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有NAFLD合并病毒性肝炎动物模型所存在的不足，提供 一种建立NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型的方法，用该方法建立的小鼠模型克服了现有 NAFLD合并病毒性肝炎动物模型所存在的不足，模型小鼠构建成本低廉、易于复现、临床症 状明显、具有完整的病毒感染及复制周期，并可以刺激免疫系统产生抗病毒免疫应答，可以 复制出NAFLD合并病毒性肝炎的多种特征且与人类情况类似。 为实现本专利技术的目的，本专利技术一方面提供一种非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝 炎小鼠模型的建立方法，包括对小鼠依次进行高脂饮食诱导、鼠肝炎病毒感染，构建非酒精 性脂肪性肝病合并病毒性肝炎模型小鼠。 其中，所述小鼠选择C3H/HeN纯系近交小鼠。 特别是，所述小鼠选择雌性C3H/HeN纯系近交小鼠。 其中，所述C3H/HeN纯系近交小鼠的年龄为6-7周胎龄。 特别是，所述小鼠的动物级别为SPF级。 尤其是，所述C3H/HeN纯系近交小鼠的体重为15. 8-19. 4g。 其中，所述高脂饮食诱导是采用高脂饲料喂养小鼠至少12周，构建非酒精性脂肪 性肝病小鼠。 特别是，所述高脂饮食诱导时间优选为12周。 特别是，每千克所述1?脂词料含有258g酿蛋白、162g糊精、89g鹿糖、32g ?油、 317g猪油、65g纤维素、58g矿物质、13g维生素、4gL -胱氨酸、3g酒石酸胆碱及0. 069g食 物抗氧化剂。 尤其是，将小鼠喂养于无菌过滤空气鼠笼内，控制笼内温度为22°C，相对湿度为 40%，12小时光照/黑暗交替进行，供给双蒸水，小鼠于笼内自由进食；每周更换两次垫料 及饲料。 尤其是，喂养过程中每周更换两次垫料及饲料，可防止高脂饲料变质，影响小鼠进 食。 其中，所述鼠肝炎病毒感染是对高脂饮食诱导后的小鼠注射鼠肝炎病毒，感染小 鼠，建立非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型。 特别是，所述鼠肝炎病毒选择鼠肝炎3型病毒。 特别是，采用腹腔注射的方式注射所述的鼠肝炎3型病毒。 尤其是，所述腹腔注射是在小鼠中下腹壁行腹腔内注射。 其中，所述鼠肝炎病毒的注射量为每只小鼠体内注射至少5PFU(病毒噬斑形成单 位）的鼠肝炎病毒，优选为5-15PFU，进一步优选为10PFU。 本专利技术另一方面提供一种非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型的建立 方法，包括如下顺序进行的步骤： A)高脂饮食诱导处理 在无菌过滤空气鼠笼内，自由摄取食水的条件下，采用高脂饲料喂养小鼠至少12 周，诱导获得非酒精性脂肪性肝病小鼠； B)第一次体征监测 对高脂饮食诱导处理的小鼠进行体重、体型，肝脏形态、肝脏组织学变化以及血液 中丙氨酸转氨酶、谷草转氨酶、空腹血糖、胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、胰岛素水平及 胰岛素抵抗水平测定； C)病毒感染处理 将鼠肝炎病毒通过注射的方式注入非酒精性脂肪性肝病小鼠体内，感染小鼠，建 立非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型； D)第二次体征监测 分别于病毒感染第4、8、12、16、20、30天对病毒感染小鼠外周血检测转氨酶，观察 病毒感染小鼠肝脏组织学及肝内病毒复制变化。 其中，步骤A)中所述小鼠选择C3H/HeN纯系近交小鼠。 特别是，所述小鼠选择雌性本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型的建立方法，其特征是包括对小鼠依次进行高脂饮食诱导、鼠肝炎病毒感染，构建非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎模型小鼠。
【技术特征摘要】
1. 一种非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型的建立方法，其特征是包括对小 鼠依次进行高脂饮食诱导、鼠肝炎病毒感染，构建非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎模 型小鼠。2. 如权利要求1所述的方法，其特征是所述小鼠选择C3H/HeN纯系近交小鼠。3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征是所述高脂饮食诱导是采用高脂饲料喂养小 鼠至少12周，构建非酒精性脂肪性肝病小鼠。4. 如权利要求1或2所述的方法，其特征是所述鼠肝炎病毒感染是对高脂饮食诱导后 的小鼠注射鼠肝炎病毒，感染小鼠，建立非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型。5. 如权利要求4所述的方法，其特征是所述鼠肝炎病毒选择鼠肝炎3型病毒。6. 如权利要求4所述的方法，其特征是采用腹腔注射的方式注射所述的鼠肝炎3型病 毒。7. 如权利要求4所述的方法，其特征是所述鼠肝炎病毒的注射量为每只小鼠体内注射 至少5PFU的鼠肝炎病毒。8. -种非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型的建立方法，其特征是包括如下 顺序进行的步骤...
【专利技术属性】
技术研发人员：宁琴，罗小平，习东，吴婷，王宏武，王晓晶，严伟明，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属同济医院，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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