猪脂肪组织中总蛋白的提取及ChREBP蛋白的Western blot检测方法技术

本发明专利技术公开了一种猪脂肪组织中总蛋白的提取及ChREBP蛋白的Western blot检测方法，主要步骤包括：（1）猪脂肪组织粉的制备；(2)裂解猪脂组织；(3)制备的蛋白提取物；（4）制备离心变性样品；（5）样品进行SDS‑聚丙烯酰胺凝胶电泳；（6）制备电泳图谱；（7）制备WB图谱。本发明专利技术很好地解决了穿过脂肪组织样上层的大量油状物提取蛋白的技术难点，采用本发明专利技术方法得到的样品总蛋白，经考马斯亮蓝染色后观察的图谱清晰，为Western blot的后续试验打好基础，提取的蛋白进行ChREBP的WB检测，图谱清晰，无杂带，为获得准确的结果提供了试验基础，为动物脂肪代谢相关机制的研究提供方法依据和检测标准。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种猪脂肪组织中总蛋白的提取及ChREBP蛋白的Western blot检测方法，包括如下步骤：（1）猪脂肪组织粉的制备 从液氮中取出猪脂肪组织块，置于液氮预冷的研钵中，加入适量液氮后研磨成粉末状，备用；(2) 取0.1g组织粉末于1.5 mL离心管中，用电子天平称重，按猪脂肪组织粉的质量体积比1︰10加入蛋白裂解液于离心管中，按猪脂肪组织粉的质量体积比1︰1000加入PMSF溶液于离心管中，将装有裂解液和PMSF溶液的样品冰上孵育1～3h，然后在10000‑14000g条件下离心3‑5min，放于‑80 ℃保存备用；(3) 将(2)制备的蛋白样品取出，在14000g条件下离心3‑5min，用200 µL枪头插到蛋白液体层吸取，将吸取的液体移至新的1.5 mL离心管，放于‑80 ℃冻存，得到的澄清液即为蛋白提取物，将样品分装于200 µLPCR管中，在‑80 ℃冻存，备用；（4）取(3)制备的蛋白提取物采用BCA法测定蛋白浓度；（5）根据（4）测定的蛋白浓度，按试验所需确定最小上样蛋白量，加入上样蛋白质量体积比5倍的蛋白上样缓冲液，用双蒸水补充上样总体积至15µL，然后将上样漩涡振荡，5000g离心5 min，95 ℃恒温金属浴变性5‑10 min，得离心变性样品，备用；（6）将(5)制备好的样品进行SDS‑聚丙烯酰胺凝胶电泳，待溴酚蓝跑至玻璃板底部前，停止电泳；（7）将(6)完成电泳后的其中一块凝胶置于超纯水的培养皿中，放在水平摇床上洗5min，然后用R‑250考马斯亮蓝染液染色1h，再用脱色液脱色3次，将洗脱后的凝胶用图像扫描仪扫描，即得电泳图谱；（8）将(7)完成电泳后的另一块凝胶用于做转膜，按滤纸‑胶‑NC膜‑滤纸从下至上的顺序叠放，置于装有转膜缓冲液的槽中，冰上，100伏恒压转移1h‑2h；（9）将(8)转膜结束的NC膜用TBST洗3次，每次5min，然后用5%脱脂奶粉封闭液封闭90min，将封闭好的NC膜放入用TBST稀释好的一抗中，室温摇床上孵育1 h‑2 h，然后4 ℃保存，备用；（10）取(9)制备的膜，室温孵育1 h后用TBST洗膜3次，每次10 min，然后将膜放入用TBST稀释好的二抗中，室温孵育90min，用TBST洗膜3次，每次10 min，采用ECL化学曝光法，将洗脱后的NC膜用图像扫描仪扫描，即得WB图谱。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高鹏飞，郭晓红，马丽，曹果清，李步高，杨青春，浦中得，王泽艺，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：山西;14