一种人粪便样本中脱落细胞DNA的提取试剂盒及提取方法技术

本发明专利技术提供了一种人粪便样本中脱落细胞DNA的提取试剂盒，其特征在于，包括如下试剂：1）样本保存液SPB；2）细胞捕获剂CCB；3）细胞裂解液I；4）DNA提取液I；5）DNA溶解液EB；6）无水乙醇和75%乙醇。本发明专利技术还提供了使用试剂盒用于人粪便样本中脱落细胞DNA的提取方法。本发明专利技术有以下优势和应用价值：1.样本采样简便、无创、个性便捷，无需专人协助取样，可自行取样；粪便样本取样简单（无需取粪便样本硬性要求的特定位置，随机取成型的粪便样本即可），取人者可自行取样，无需到医院由专业人士协助取样，便捷、非侵入、取样者体验友好。2.样本保存方便：常温放置即可；3.样本预处理简单：无需做离心淘洗法、密度梯度离心法、及免疫磁珠法等处理。

Extraction kit and extraction method of DNA from shedding cell in a human fecal sample

The invention provides a kit of DNA in exfoliated cells of human feces samples, which is characterized in that the reagent comprises the following: 1) the sample solution SPB; 2) cell capture agent CCB; 3) cell lysate of I; 4) DNA extract I; 5) DNA EB 6) anhydrous solution; ethanol and 75% ethanol. The invention also provides a method for the use of a kit for the extraction of DNA from the shedding cells in human fecal samples. The invention has the following advantages and application value: 1. sampling is simple, noninvasive, convenient personality, without special assistance to sampling, sampling; sampling simple stool samples (fecal samples can be the specific position, without taking the required stool samples randomly selected from others, forming) can be sampled without to assist the hospital sampling by professionals, convenient, non-invasive, friendly experience sampling. 2., the sample is easy to store: it can be placed at room temperature; the 3. sample pretreatment is simple: no need to do centrifugal elutriation, density gradient centrifugation and immunomagnetic beads.

【技术实现步骤摘要】
一种人粪便样本中脱落细胞DNA的提取试剂盒及提取方法
本专利技术涉及医学生物领域中核酸(DNA)的提取方法，具体涉及从人类粪便中提取脱落细胞DNA的方法及应用。
技术介绍
粪便是食物经口咀嚼，经食道到达胃后，通过胃的消化，进入十二指肠，同时在胆汁与胰液的共同作用下，经小肠消化和吸收后，最终大肠中形成的残渣排泄物。粪便是保持机体内环境稳定的最终代谢产物，除了含有水、蛋白质、无机物、脂肪、未消化的食物纤维外，还含有细菌细胞、病毒及器官的表皮脱落细胞等。粪便中的细菌主要来源于肠道菌群或者少量来源于食物；器官的表皮脱落细胞主要来源于大肠。粪便中不但蕴藏着丰富的生物学信息，且具有非侵入性、无创、采样便捷、来源广泛等优点。粪便的成分及含量的改变不仅受消化系统的影响，而且与血液循环、代谢、呼吸等系统的生理或病理变化有关。从粪便样本中分离出总核酸，并对这些核酸序列进行分子检测(电泳分析、Q-PCR、Sanger及NGS等技术)，可以帮助对肿瘤、肠道微生物、艾滋病、疟疾等潜在的重大疾病的早期、无创的分子检测。由于粪便中的脱落细胞含量很低，采用常规的核酸提取方法难以从粪便脱落细胞中获取足量且高质量的核酸。粪便的放置条件、放置的时间等条件都会影响粪便样本中脱落细胞的完整性，进而影响提取核酸时的回收率。为了从粪便中以高回收率获取高质量的核酸，通过采用样本保存液常温保存样本和脱落细胞浓缩捕获方法，从而简化样本采样和保存流程、缩短样本预处理时间，非常方便实际科研和生产的应用。在采用离心柱法提取核酸时，通常将样品离心通过吸附柱，使样品中的核酸在高盐条件下结合到吸附柱的硅胶模上。然而这样的上样方法对于核酸含量低、样品量较大的粪便样本液而言，不但需要大量的提取试剂，而且上量离心时间过长，不利于核酸的提取。鉴于此难题，尽管近年来许多研究提出相应解决的方法如：离心淘洗法、密度梯度离心以及免疫磁珠法，但这些研究方法具有对粪便取样要求苛刻、粪便样本保存要求高、对耗材和设备要求高、操作流程繁琐而耗时等的缺陷，另外市面上已有一些粪便DNA提取试剂盒不但不能完全解决这些难题，而且最终提取DNA的实际质量并不能达到官方公开的指标，另外价格也比较昂贵，难以实现在分子检测的应用。因此针对粪便中核酸含量低、提取核酸时所需样本量较大的情况下，专利技术一种从粪便中快速富集并提取核酸的方法，将对临床粪便样本进行无创的分子检测具有重要的应用价值。本专利技术提供了粪便样本保存液和脱落细胞富集捕获的简易方法，可将大量的粪便样本浓缩处理后，快速富集至核酸吸附柱上，再经洗涤、洗脱步骤提取出高质量的核酸，可用于分子检测。
技术实现思路
本专利技术针对上述现有技术所存在不足之处开展的实验研究，目的在于提供一种快速简易、低成本、稳定性和重复性高的从粪便中提取人基因组DNA试剂盒及提取的方法。本专利技术的人类粪便DNA提取方法，其实质是自粪便中提取排便人的肠道上皮脱落细胞的DNA，所要解决的技术是不仅能使DNA完整从细胞中释放出来，并且保证在常规一系列的分离、沉淀和纯化技术过程中不被破坏，从而得到浓度和纯度较高的人基因组DNA样本。本专利技术的粪便脱落细胞提取试剂盒，包括如下试剂：1)样本保存液SPB；2)细胞捕获剂CCB；3)细胞裂解液I；4)DNA提取液I；5)DNA溶解液EB；6)无水乙醇和75％乙醇。本专利技术提供的粪便脱落细胞提取试剂盒所含试剂及耗材见表1，提取流程为在15ml的保存液SPB中加入5g左右成型粪便样本(采样时，将样本加到保存液指定的液面即可)，高速漩涡振荡混合均匀，离心取1ml上清，加入等体积的细胞捕获剂CCB混合均匀后，离心获得细胞沉淀物，加入300ulDNA细胞裂解液I，混合均匀使沉淀物溶解后，56℃孵育10-15min，加入300ulDNA提取液I混合均匀后，再加入1.2ml的无水乙醇沉淀核酸，混合均匀后将样品全部通过核酸吸附柱，样品中的核酸将结合到吸附柱的硅胶膜上，用75％的乙醇洗涤三次吸附柱后，待乙醇挥发干净后再用DNA溶解液EB将核酸从吸附柱上洗脱下来。表1：粪便样本核酸快速提取试剂盒及所含试剂本专利技术的专利技术人根据目标样品的不同，例如对于健康男性、健康女性、结直肠癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌患者等粪便样本，经过反复实验，对各因素进行优化、摸索出最适应操作步骤及相应的溶液的最佳配方。表2：样本保存液SPB的配方其中EDTA是稳定剂，使保存液可在室温放置；Tris是缓冲剂，维持细胞内外渗透压、PH值；Nacl可维持电解质平衡，维持细胞渗透压。粪便样本保存液SPB的PH值调为7最佳，一般保存液SPB与样本比例为3:1最佳，大于这个比例，保存液过多，粪便样本被稀释，后面脱落细胞浓缩捕获难度大；小于这个比例样本不能保证彻底溶解在保存液中，导致脱落细胞有损耗，一般要求在这个比例下粪便样本量至少达到5g，对应的保存液SPB的体积为15ml，一般样本量越大，DNA回收的浓度也高。保存液SPB可实现粪便样本常温保存，不需要低温保存，方便粪便保存和运输管理。本专利技术对粪便的采样要求简单(无需硬性地对粪便样本指定表面位置刮取采样)、个性便捷、无创取样，取样者可自行居家取样即可，无需专门到医院取样，可实现常温保存与运输，保存时间至少可达15天。表3：细胞捕获剂CCB的配方PEG有吸水性，会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。在一定PH值下，盐浓度越高，所需PEG的浓度越低，溶液的PH越接近目的物的等电点，沉淀所需PEG浓度越低。通过多次试验，PEG6000的浓度可选取在150g/l-250g/l，最适合为200g/L；NaCl可选择在2mol/L-5mol/L，最适合在3.5mol/L。表4：细胞裂解液I的配方表5：DNA提取液I的配方表6：DNA溶解液EB的配方DNA溶解的成分可以是灭菌水或者无酶水，只要是对DNA溶解度大、有保存DNA的能力，而且不会影响下游分子检测实验即可。本专利技术的人粪便样本中脱落细胞DNA的提取方法，提取出的核酸包含了粪便中人脱落细胞的基因组DNA、细菌的DNA、病毒DNA和其他潜在的游离的核酸。本专利技术的试剂盒与现有技术相比，有如下创新点：1)增加了预处理的步骤，可以大量富集细胞；2)提取得到的DNA浓度相对增高。本专利技术有以下优势和应用价值：1.样本采样简便、无创、个性便捷，无需专人协助取样，可自行取样；粪便样本取样简单(无需取粪便样本硬性要求的特定位置，随机取成型的粪便样本即可)，取人者可自行取样，无需到医院由专业人士协助取样，便捷、非侵入、取样者体验友好。2.样本保存方便：常温放置即可；3.样本预处理简单：无需做离心淘洗法、密度梯度离心法、及免疫磁珠法等处理；4.可实现大量粪便样本的DNA提取，特别适合是脱落细胞稀少的粪便样本；使用脱落细胞捕获剂CCB(由200g/L的PEG6000、3.5mol/L的NaCL配制而成)，使最终回收的核酸能满足下游分子检测的需求，特别是能解决粪便中脱落细胞偏少的样本核酸提取的难题。5.DNA提取流程简易，易于粪便样本批量提取的处理；6.对试剂和耗材成本低、来源广、易于保存和管理，且廉价易得、安全无刺激性气味和毒性。7.稳定性和重复性好：正常人的粪便样本中人基因组DNA一般平均在10-100ng/ul；结直肠癌患本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人粪便样本中脱落细胞DNA的提取试剂盒，其特征在于，包括如下试剂：1)样本保存液SPB；2)细胞捕获剂CCB；3)细胞裂解液I；4)DNA提取液I；5)DNA溶解液EB；6)无水乙醇和75％乙醇；其中，所述的样本保存液SPB的组分及各组分在样本保存液SPB中的含量如下：EDTA 100mMol/L；Tris 0.5mol/L；NaCl 10mMol/L；所述的样本保存液SPB的pH值为7；所述的细胞捕获剂CCB的组分及各组分在细胞捕获剂CCB中的含量如下：PEG6000 150‑250g/L；NaCl 2‑5mol/L；所述的细胞裂解液I的组分及各组分在细胞裂解液I中的含量如下：异硫氰酸胍472.5mg/ml；EDTA20mmol/L；二硫苏糖醇32.5mmol/l；TritonX‑100 4％v/v；Tris‑HCl 10mmol/L；细胞裂解液I的pH值为6.5；所述的DNA提取液I的组分及浓度如下：盐酸胍573g/L；所述的DNA溶解液EB的组分及浓度如下：Tris‑HCL 10mM。

【技术特征摘要】
1.一种人粪便样本中脱落细胞DNA的提取试剂盒，其特征在于，包括如下试剂：1)样本保存液SPB；2)细胞捕获剂CCB；3)细胞裂解液I；4)DNA提取液I；5)DNA溶解液EB；6)无水乙醇和75％乙醇；其中，所述的样本保存液SPB的组分及各组分在样本保存液SPB中的含量如下：EDTA100mMol/L；Tris0.5mol/L；NaCl10mMol/L；所述的样本保存液SPB的pH值为7；所述的细胞捕获剂CCB的组分及各组分在细胞捕获剂CCB中的含量如下：PEG6000150-250g/L；NaCl2-5mol/L；所述的细胞裂解液I的组分及各组分在细胞裂解液I中的含量如下：异硫氰酸胍472.5mg/ml；EDTA20mmol/L；二硫苏糖醇32.5mmol/l；TritonX-1004％v/v；Tris-HCl10mmol/L；细胞裂解液I的pH值为6.5；所述的DNA提取液I的组分及浓度如下：盐酸胍573g/L；所述的DNA溶解液EB的组分及浓度如下：Tris-HCL10mM。2.根据权利要求1所述的人粪便样本中脱落细胞DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明，杨俊，陆颖锶，韩丽娜，黄曦，何金津，周进生，丘远辉，
申请(专利权)人：泰州达安达瑞医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32