核酸的分离制造技术

公开了从生物材料分离包含DNA的核酸的方法。所述方法包括使用水性组合物产生裂解的组合物的裂解步骤，所述水性组合物包含浓度为0.05‑1.0M的锂、螯合剂和表面活性剂。在存在浓度为0.05‑2M的溶解的离液剂和25体积％‑60体积％的C1‑3链烷醇的条件下，将所述裂解的组合物用能够固定DNA的固体载体处理。然后将所述载体用包含溶解在C1‑3链烷醇中的锂的第一洗涤溶液洗涤。随后，将所述载体用包含至少80体积％的C1‑3链烷醇的液体洗涤。然后，从所述载体上洗脱包含DNA的核酸。

Separation of nucleic acid

The method of separating nucleic acid containing DNA from biomaterials is disclosed. The method comprises the steps of cracking composition using an aqueous composition which produced by pyrolysis of an aqueous composition comprises a concentration of 0.05 1.0M lithium, chelating agent and surface active agent. In the presence of 0.05 2M concentration of dissolved chaotropic agent and 25 vol% 60 vol% C1 3 alkanol conditions, the cleavage of the composition can handle fixed solid carrier DNA. Then the carrier with the first washing washing solution contains dissolved in C1 3 alkanol in lithium. Subsequently, the carrier comprises at least 80 vol% C1 3 alkanol washing liquid. Then, the nucleic acid containing DNA is eluted from the carrier.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸的分离本专利技术涉及从生物材料(例如，细胞)中分离包含DNA的核酸，其利用裂解工序并且处理裂解物而分离包含DNA的核酸。更具体地，本专利技术包括将来自裂解的生物材料的包含DNA的核酸固定在固体载体上，纯化在所述载体上的包含DNA的核酸，然后从所述载体上洗脱所述包含DNA的核酸以用于收集。本专利技术的具体目的是提供一种相对快速且直接实施的并且以良好的产率产生高纯度的包含DNA的核酸的方法。本专利技术还涉及用于所述裂解工序的组合物。在众多领域中，例如，研究和临床诊断中，从生物材料(例如，细胞)分离纯的、完整的包含DNA的核酸是重要的。由此，纯粹通过举例的方式，临床上来自患者的包含细胞的样品可以进行工序处理(包括细胞裂解的步骤)，以分离包含DNA的核酸，然后将其通过本领域公知的工序进行分析。这样的分析可以是用于鉴定来自特定细菌的DNA的目的(以确定所述患者是否已被所述细菌感染)或可以是用于所述患者的DNA是否具有一种或多种造成医学病况的点突变的目的。US-A-8598338公开了使用固体载体从生物材料(例如，细胞)分离DNA的组合物和方法。所述方法包括至少下述步骤：(a)用缓冲的裂解组合物裂解所述生物材料，所述裂解组合物包含：(i)锂盐，例如，氯化锂，浓度为至少1M，但是优选高得多的浓度(多至10M)，(ii)表面活性剂，其可以是浓度为0.05至0.2％的SDS，但是优选地是以高得多的浓度(例如，至少5％)存在的非离子表面活性剂，和(iii)任选的螯合剂；(b)将来自(a)的组合物与“DNA掺加溶液”混合，所述DNA掺加溶液可以是(i)无水醇(例如，甲醇、乙醇或最优选地是异丙醇)，或(ii)浓度为10-15M的锂盐溶液；(c)使得到的混合物与固体载体接触，从而固定来自裂解的材料的DNA；(d)用包含醇的洗涤液洗涤所述载体，并且(e)洗脱所述DNA。尽管US-A-8598338的总公开内容没有排除，但是高度优选的是，其工序不使用离液剂(例如，胍盐)实施。实施例4和5中所述的工序按照上述教导进行，并且使用6MLiCl裂解溶液和10MLiCl“DNA掺加溶液”。US-A-8598338的工序具有下述缺点：在所述裂解组合物和“DNA掺加溶液”中所用的高锂盐浓度具有锂盐污染所分离的DNA的风险。在这一点上，已知30Mm的LiCl抑制PCR反应，参见作者为Ganaie等人的以“InhibitionofPolymeraseChainReactionbyLithiumChloride(借助氯化锂的聚合酶链式反应的抑制)”为题的文献(InternationalJournalofLifeScience&PharmaResearch，Vol.2/Issue4，2012年10-12月，第L1-L5页)。因此，LiCl污染可能影响下游应用。因此，本专利技术的一个目的是避免或减轻上述缺点。根据本专利技术的第一方面，提供从生物材料分离包含DNA的核酸的方法，所述方法包括下述步骤：(i)用水溶液实施所述生物材料的裂解，以产生水性的裂解的组合物，所述水溶液包含浓度为0.05-1.0M的锂、螯合剂和表面活性剂，(ii)在存在浓度为0.05-2M的溶解的离液剂和25体积％-60体积％的溶解的C1-3链烷醇液体的条件下，用固体载体处理所述裂解的组合物，所述固体载体能够固定DNA，(iii)将所述固体载体与液体分离，(iv)用包含浓度为0.05-1M的锂盐的第一洗涤溶液处理所述固体载体，所述第一洗涤溶液包含20体积％-90体积％的溶解的C1-3链烷醇，(v)将所述固体载体与所述第一洗涤液分离，(vi)用第二洗涤液处理所述固体载体，所述第二洗涤液包含至少80体积％的C1-3链烷醇，如果存在余量的话，余量为水，(vii)将所述固体载体与所述第二洗涤溶液分离，和(viii)从所述固体载体上洗脱包含DNA的核酸。在本说明书的附录1中限定了可以以任意组合使用的本专利技术优选的特征。通过本专利技术的方法分离的包含DNA的核酸可以结合RNA，并且可以是总核酸。本专利技术提供包含DNA的核酸的分离方面的优异的结果。与US-A-8598338的教导相反，裂解工序使用相对低浓度的锂盐，并且还使用离液剂(优选胍盐)。分离的包含DNA的核酸是高纯的，由于在本专利技术的方法中使用相对低量的锂盐，因此存在很少被锂盐污染的风险。本专利技术的方法得到基本上纯的且基本上完整的包含DNA的核酸的分离。本专利技术第二方面的方法可以用于从宽范围的生物来源的包含DNA的样品中分离包含DNA(特别是基因组DNA)的核酸。要从中分离DNA的样品可以是，或可以包含，细胞，例如，动物(包括哺乳动物)细胞、植物细胞、细菌细胞或酵母或其他真菌细胞。备选地，要从中分离DNA的样品可以是，或可以包含，一种或多种病毒。要从中分离包含DNA的核酸的细胞、一种或多种病毒或其他包含DNA的样品可以来源于或已经存在于组织样品或体液中，如血液、痰、尿液或CSF中。在某些实施方案中(例如，关于革兰氏阴性细菌的裂解)，本专利技术的方法可以无需使用蛋白酶(例如，蛋白酶K)处理细胞和无需加热步骤而实施。在其他实施方案中(例如，关于组织(如用于裂解全血细胞目的的血液)处理和关于革兰氏阳性细菌的裂解)，样品可以另外用蛋白酶(例如，蛋白酶K)处理。在后一些实施方案中，用蛋白酶(蛋白酶K)处理可以与用包含锂的裂解溶液处理同时起作用。通过本专利技术的方法得到的包含DNA的核酸是足够纯的，足以用于通过本领域公知的技术进行其他分析的目的。例如，DNA可以用于研究目的或在需要时用于医学病症的诊断。本专利技术的方法可以便利地在要裂解的生物材料(例如细胞)的球粒上实施。所述球粒可以通过使用本领域公知的技术将包含所述生物材料的液体样品离心而产生。在本专利技术用于从生物材料(例如细胞)样品分离包含DNA的核酸的方法的步骤(i)中，将所述材料用水性组合物裂解，所述水性组合物包含浓度为0.05-1.0摩尔/升的锂(由锂盐提供)、螯合剂和表面活性剂。所述组合物可以包含所述的成分，可以基本上由所述的成分组成，或由这些成分组成。锂盐优选地是卤化锂，最优选是氯化锂，并且优选地，以0.05至小于1摩尔/升、优选0.1-0.9摩尔/升、更优选0.6-0.9摩尔/升、甚至更优选0.75-0.85摩尔/升并且最优选约0.8摩尔/升的浓度存在于所述组合物中。所述螯合剂，最优选是EDTA或其盐，如碱金属(例如，钠)盐，优选地以1-20mM/L，更优选8-15毫摩尔/升、更优选9-11毫摩尔/升并且最优选约10毫摩尔/升的浓度存在于所述组合物中。所述表面活性剂可以是非离子表面活性剂，但是更优选是阴离子表面活性剂，最优选是SDS。所述裂解溶液可以具有7-8的pH，但是不必须缓冲至该范围内的pH。因此，所述裂解溶液可以是无缓冲型组合物。在实施本专利技术方法的第一实施方案中，要裂解的材料(例如，以球粒形式)可以用裂解溶液处理，所述裂解溶液包含本专利技术方法步骤(i)中限定的成分，基本上由本专利技术方法步骤(i)中限定的成分组成或由本专利技术方法步骤(i)中限定的成分组成。所述材料(例如细胞)与所述组合物彻底混合(例如，通过移液)，并且在环境温度实施裂解持续适当的时间段。通常，15-25分钟，例如约20分钟的时间段是合适的。根据该第本文档来自技高网...

【技术保护点】
从生物材料分离包含DNA的核酸的方法，所述方法包括下述步骤：(i)用水溶液实施所述生物材料的裂解，以产生水性的裂解的组合物，所述水溶液包含浓度为0.05‑1.0M的锂、螯合剂和表面活性剂，(ii)在存在浓度为0.05‑2M的溶解的离液剂和25体积％‑60体积％的溶解的C1‑3链烷醇液体的条件下，用固体载体处理所述裂解的组合物，所述固体载体能够固定DNA，(iii)将所述固体载体与液体分离，(iv)用包含浓度为0.05‑1M的锂的第一洗涤溶液处理所述固体载体，所述第一洗涤溶液包含20体积％‑90体积％的溶解的C1‑3链烷醇，(v)将所述固体载体与所述第一洗涤液分离，(vi)用第二洗涤液处理所述固体载体，所述第二洗涤液包含至少80体积％的C1‑3链烷醇，如果存在余量的话，余量为水，(vii)将所述固体载体与所述第二洗涤溶液分离，和(viii)从所述固体载体上洗脱DNA。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.17 GB 1504459.71.从生物材料分离包含DNA的核酸的方法，所述方法包括下述步骤：(i)用水溶液实施所述生物材料的裂解，以产生水性的裂解的组合物，所述水溶液包含浓度为0.05-1.0M的锂、螯合剂和表面活性剂，(ii)在存在浓度为0.05-2M的溶解的离液剂和25体积％-60体积％的溶解的C1-3链烷醇液体的条件下，用固体载体处理所述裂解的组合物，所述固体载体能够固定DNA，(iii)将所述固体载体与液体分离，(iv)用包含浓度为0.05-1M的锂的第一洗涤溶液处理所述固体载体，所述第一洗涤溶液包含20体积％-90体积％的溶解的C1-3链烷醇，(v)将所述固体载体与所述第一洗涤液分离，(vi)用第二洗涤液处理所述固体载体，所述第二洗涤液包含至少80体积％的C1-3链烷醇，如果存在余量的话，余量为水，(vii)将所述固体载体与所述第二洗涤溶液分离，和(viii)从所述固体载体上洗脱DNA。2.权利要求1所述的方法，其中所述裂解溶液基本上由下述组成：水，浓度为0.7-0.9M的氯化锂，浓度为5-15mM的EDTA或其钠盐和0.9-1.1重量％的SDS。3.权利要求2所述的方法，其中在步骤(ii)中，所述离液剂是浓度为0.6-0.7M的胍氯化物，并且所述链烷醇是以所述液体的35-40体积％的量存在的乙醇。4.权利要求1所述的方法，其中所述裂解溶液基本上由下述组成：水，浓度为0.2-0.3M的氯化锂，浓度为1-5mM的EDTA或其钠盐，浓度为0.6-0.7M的胍氯化物，量为0.2-0.4重量％的SDS和35-40体积％的乙醇。5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述第一洗涤液基本上由下述组成：水，浓度为0.3-0.6M的氯化锂和45体积％-55体积％的乙醇。6.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述第一洗涤液基本上由下述组成：水，浓度为0.6-1M的氯化锂和45体积％-55体积％的乙醇。7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述第二洗涤液基本上由80体积％-95体积％的乙醇和水组成。8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述固体载体包含二氧化硅。9.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中步骤(iii)在离心管中实施，在所述离心管中，所述固体载体是过滤器，并且步骤(iii)、(v)、(vii)和(viii)通过离心实施。10.权利要求9所述的方法，其中所述过滤器包括硼硅酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯蒂芬·约翰·敏特，乔尔乔斯·派特索斯，
申请(专利权)人：雷沃卢金有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB