一种改良CTAB法提取棉花基因组DNA制造技术

本发明专利技术公开了一种改良CTAB法提取棉花基因组DNA，包括以下步骤：（1）液氮研成粉末，加入CTAB 缓冲液65℃水浴摇动得含有DNA的提取液I；（2）冷却后加入RNase A后进行37℃水浴；（3）加入等体积的溶液A混匀离心得上清液I；（4）继续加入等体积的溶液A混匀离心得上清液II；（5）加入NaAc，然后加入无水乙醇水平摇动形成絮状沉淀；（6）离心，弃上清，洗涤沉弃去无水乙醇，干燥得沉淀DNA；（7）溶解沉淀DNA，保存于‑20℃冰箱中备用。本发明专利技术精简了CTAB法提取棉花叶片基因组DNA的步骤程序，大大缩短了实验时间，还降低了DNA提取成本，提高了RNA的消除效果，适合棉花叶片基因组DNA的大批量提取。

【技术实现步骤摘要】
一种改良CTAB法提取棉花基因组DNA
本专利技术涉及DNA提取
，具体涉及一种改良CTAB法提取棉花基因组DNA。
技术介绍
近年来，随着作物数量性状基因位点定位研究的深入开展，分子标记技术越来越广泛地被科研和育种单位应用于作物标记辅助育种。在作物标记辅助育种程序中，高通量、快速、低成本提取作物单株的DNA一直是科研和育种者的理想目标。在棉花分子标记辅助选择工作中，一般是从棉株叶片中提取DNA样品，与其他植物的DNA提出不同的是，棉花叶片中除富含蛋白外，还含有较多的棉酚、多糖、单宁等次生代谢物，这些代谢物在细胞破裂时容易氧化，氧化后与蛋白质、核酸等发生不可逆反应，形成棕色胶状复合物，影响后续的实验工作，因此导致棉花叶片DNA提取的步骤较其他作物更为复杂。目前，常用的棉花叶片DNA提取方法是CTAB法。这种方法包括田间取样、组织破碎、提取缓冲液预处理、裂解缓冲液裂解细胞、去除蛋白质及RNA等杂质、沉淀DNA、漂洗DNA和溶解等环节。但是，传统的CTAB法，在对棉花基因组中RNA进行清除时，需要将DNA溶解后再抽提一遍，这使提取步骤变得十分繁琐复杂，耗时长且DNA得率低。也有实验室采用商品化的试剂盒提取棉花叶片DNA，商品化的试剂盒一般是在SolutionI中添加RNaseA，过柱前就将RNA切成小片段，而且RNA相较基因组DNA普遍偏小，过柱时无法挂到柱上，因此得以除去RNA。商品化的试剂盒虽然RNA去除效果好，耗费时间短，但是造价高昂，并不适合大批量的材料处理。近几年来，国内外对基因组测序研究愈加重视，各国都加大了研究投资力度。但基因组测序对基因组DNA的质量要求高，RNA的存在严重影响了基因组测序的质量，并且往往需要在短时间处理大量的样本，因此需要一种精简清除RNA的植物基因组提取方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种改良CTAB法提取棉花基因组DNA，用以解决现有的DNA提取方技术步骤繁琐，且RNA去除耗时长的技术问题。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为一种改良CTAB法提取棉花基因组DNA，包括以下步骤：（1）取材料，用液氮研成粉末，移入离心管，加入CTAB缓冲液后充分摇匀，在65℃水浴中反应40~60分钟，每隔10min轻轻摇动，得到含有DNA的提取液I；（2）将盛有DNA的提取液I离心管放置冰中降温后，加入RNaseA后进行水浴；（3）向反应后的DNA的提取液I中加入等体积的溶液A振荡混匀3min，10000r/min离心10min得上清液I；所述溶液A由氯仿：异戊醇按照24:1的体积比混合而成；（4）向上清液I中加入等体积的溶液A，振荡混匀3min，10000r/min离心10min得上清液II；（5）向上清液II中加入0.1倍体积的3MNaAc，然后缓慢加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，水平摇动离心管5min形成絮状沉淀；（6）于10000r/min、4℃下离心5min，弃上清，用70％乙醇清洗沉淀两次，无水乙醇清洗沉淀一次，弃去无水乙醇，干燥得沉淀DNA；（7）溶解沉淀DNA，保存于-20℃冰箱中备用。优选的，步骤（1）中，所述材料选用陆地棉的叶片。优选的，步骤（1）中，所述材料与CTAB缓冲液按照m:v为1~2:10进行混合。优选的，步骤（1）中，所述CTAB缓冲液中含有：1.4MNaCl，0.02MEDTA，0.1MTris-HCl，2%十六烷基三甲基溴化铵，2%PVP-K30，0.1%DIECA，0.2%β-巯基乙醇，溶剂为去离子水；其中，β-巯基乙醇用时现加。优选的，步骤（2）中，将盛有DNA的提取液I离心管放置冰中降温后，按照体积百分比向DNA的提取液I中加入0.25％~1％的RNaseA，然后于27~37℃水浴条件下反应7.5~60min。优选的，步骤（2）中，将盛有DNA的提取液I离心管放置冰中降温后，按照体积百分比向DNA的提取液I中加入0.5％的RNaseA，然后于37℃水浴条件下反应7.5min。优选的，步骤（2）中，将盛有DNA的提取液I离心管放置冰中降温后，按照体积百分比向DNA的提取液I中加入0.25％的RNaseA，然后于37℃水浴条件下反应7.5min。优选的，步骤（7）中，用100μl灭菌超纯水溶解沉淀DNA。优选的，步骤（7）中，用50~100μlTE缓冲液溶解沉淀DNA；所述TE缓冲液中含有1MTrisCl，0.5MEDTA，溶剂为去离子水，所述TE缓冲液溶的pH为8.0。本专利技术提供了一种改良CTAB法提取棉花基因组DNA，其利用CTAB溶液在不同温度下裂解能力的差异发挥RNaseA的作用，清除基因组DNA中存在的RNA，简化植物基因组RNA清除过程。本专利技术方法具有如下优点：（1）相较于现有的提取方法中先完成DNA提取后再单独进行RNA清除，本专利技术反其道而行之，减少了操作步骤和程序，节约了成本，大大缩短了DNA的提取时间，加快了实验进度。（2）本专利技术将RNaseA消化提前，无需对提取完成的DNA再进行消化和抽提，并且减少了提取液的抽提次数和DNA沉淀的洗涤次数，保证了DNA的得率。（3）本专利技术的RNA消除效果好，获得的DNA质量高且稳定，有利于后续的实验研究。（4）本专利技术的改良CTAB法不光适用于棉花叶片基因组中RNA的消除，也可用于棉花、玉米、小麦、大豆、水稻、烟草等其他作物。本专利技术精简了CTAB法提取棉花叶片基因组DNA的步骤程序，大大缩短了实验时间，还降低了DNA提取成本，提高了RNA的消除效果，适合棉花叶片基因组DNA的大批量提取。附图说明图1为本专利技术实施例2的琼脂糖凝胶电泳图，泳道1为天根DP320试剂盒提取陆地棉叶片基因组DNA，泳道2~6中RNaseA的水浴温度分别为22℃、27℃、32℃、37℃、65℃；图2为本专利技术实施例3的琼脂糖凝胶电泳图，泳道1为天根DP320试剂盒提取陆地棉叶片基因组DNA，泳道2~6中RNaseA的消化时间分别为2h、1h、0.5h、15min、7.5min；图3为本专利技术实施例4的琼脂糖凝胶电泳图，泳道1~6中RNaseA的使用量分别为1%、0.5%、0.25%、0.125%、0.0625%、0.03125%（v/v）。图4为本专利技术实施例5的琼脂糖凝胶电泳图，泳道1~3为通过实施例4方法获得的陆地棉叶片基因组DNA，泳道4~6为通过实施例5方法获得的陆地棉叶片基因组DNA；图5为本专利技术的实施例6~10的琼脂糖凝胶电泳图，泳道1~5分别为玉米、小麦、大豆、水稻、烟草的基因组DNA。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1陆地棉叶片的基因组DNA提取一种改良CTAB法提取棉花基因组DNA，包括以下步骤：（1）以陆地棉的叶片作为实验材料，取100~200mg试样装入2.0mL离心管中，用液氮研成粉末，然后加入1000μL的CTAB缓冲液后充分摇匀，在65℃水浴中反应40~60分钟，每隔10min轻轻摇动，得到含有DNA的提取液I。所述粉末与CTAB缓冲液按照m:v为1~2:10进行混合。所述CTAB缓冲液中含有：1.4MNaCl（氯化钠），0.02MEDTA（pH8.0），0.1MTris-HCl（pH7.5），2%（w/v）十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改良CTAB法提取棉花基因组DNA，其特征在于，包括以下步骤：（1）取材料，用液氮研成粉末，移入离心管，加入CTAB 缓冲液后充分摇匀，在65℃水浴中反应40~60分钟，每隔10min 轻轻摇动，得到含有DNA的提取液I；（2）将盛有DNA的提取液I离心管放置冰中降温后，加入RNase A后进行水浴；（3）向反应后的DNA的提取液I中加入等体积的溶液A振荡混匀3min，10000r/min离心10min得上清液I；所述溶液A由氯仿：异戊醇按照24:1的体积比混合而成；（4）向上清液I中加入等体积的溶液A，振荡混匀3min，10000r/min离心10min得上清液II；（5）向上清液II中加入0.1倍体积的3M NaAc，然后缓慢加入2倍体积的‑20℃预冷的无水乙醇，水平摇动离心管5min形成絮状沉淀；（6）于10000 r/min、4℃ 下离心5min，弃上清，用70％乙醇清洗沉淀两次，无水乙醇清洗沉淀一次，弃去无水乙醇，干燥得沉淀DNA；（7）溶解沉淀DNA，保存于‑20℃冰箱中备用。

【技术特征摘要】
1.一种改良CTAB法提取棉花基因组DNA，其特征在于，包括以下步骤：（1）取材料，用液氮研成粉末，移入离心管，加入CTAB缓冲液后充分摇匀，在65℃水浴中反应40~60分钟，每隔10min轻轻摇动，得到含有DNA的提取液I；（2）将盛有DNA的提取液I离心管放置冰中降温后，加入RNaseA后进行水浴；（3）向反应后的DNA的提取液I中加入等体积的溶液A振荡混匀3min，10000r/min离心10min得上清液I；所述溶液A由氯仿：异戊醇按照24:1的体积比混合而成；（4）向上清液I中加入等体积的溶液A，振荡混匀3min，10000r/min离心10min得上清液II；（5）向上清液II中加入0.1倍体积的3MNaAc，然后缓慢加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，水平摇动离心管5min形成絮状沉淀；（6）于10000r/min、4℃下离心5min，弃上清，用70％乙醇清洗沉淀两次，无水乙醇清洗沉淀一次，弃去无水乙醇，干燥得沉淀DNA；（7）溶解沉淀DNA，保存于-20℃冰箱中备用。2.根据权利要求1所述的改良CTAB法提取棉花基因组DNA，其特征在于：步骤（1）中，所述材料选用陆地棉的叶片。3.根据权利要求2所述的改良CTAB法提取棉花基因组DNA，其特征在于：步骤（1）中，所述材料与CTAB缓冲液按照m:v为1~2:10进行混合。4.根据权利要求3所述的改良CTAB法提取棉花基因组DNA，其特征在于：步骤（1）中，所述CTAB缓冲液中含有：1.4MNa...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁霄，李朋波，雷梦林，温思钰，杨六六，罗晓莉，秦丽霞，潘转霞，李换丽，吴翠翠，朱永红，夏芝，曹彩荣，
申请(专利权)人：山西省农业科学院棉花研究所，山西省农业科学院农作物品种资源研究所，
类型：发明
国别省市：山西,14