使用核酸外切酶和链移位的核酸扩增制造技术

提供了扩增核酸序列的方法。该方法包括提供扩增混合物，其包含能够从5′‑末端朝向3′‑末端消化双链核酸分子的链的核酸外切酶、链移位聚合酶、包含第一和第二核酸链的双链核酸分子、第一核酸引物和适合于供给用于扩增所述待扩增的第一核酸序列的核苷酸。该方法还包括在允许消化、核酸外切酶消化和链移位聚合的条件下实现扩增反应，从而产生包含扩增量的所述第一核酸序列的产物混合物。还提供了使用双链探针确定生物样品中靶核酸序列的存在或数量的方法，所述双链探针在一条链上具有荧光团并且在另一条链上具有其猝灭剂，并且使用变性和再杂交来检测靶标。

Amplification of nucleic acid using nucleic acid exonuclease and chain translocation

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用核酸外切酶和链移位的核酸扩增本专利技术涉及核酸的扩增，并且对扩增量的特定靶序列的产生具有特定的(但不一定是排他性的)应用，用于医学诊断程序的目的的检测。许多医学病症的特征在于(在患者体内)存在具有特定核苷酸序列的核酸。核酸序列可以，例如，是存在于病原细菌、病毒或已经“侵入”患者的身体并且导致患者的疾病的其他微生物的核酸序列。在许多这样的情况下，可以通过分析来自患者的样品(例如组织、血液、尿液、痰等)以确定表征微生物的核酸序列(在样品中)的存在来诊断患者体内微生物的存在。然而，在许多情况下，样品中的表征核酸序列的量非常低并且低于可检测的限度。因此，为了检测的目的，采用扩增程序来提高表征序列(或其表征变体，例如衍生自表征rRNA序列的DNA序列)的量。根据本专利技术的第一方面，提供了一种扩增核酸序列的方法，其包括：(a)提供扩增混合物，所述扩增混合物包含：(i)能够实现双链核酸分子的链的消化的核酸外切酶，所述消化从所述链的5'-末端朝向3'-末端，(ii)链移位聚合酶，(iii)双链核酸分子，其包含彼此杂交的第一和第二核酸链，包含待扩增的第一核酸序列并具有远离其5'-末端的第一5'-末端区的所述第一链具有抵抗通过如(i)所定义的所述核酸外切酶的消化(在该方法的条件下)的核苷酸序列，(iv)第一核酸引物，其具有与第一核酸的第一末端区相同的核苷酸序列，并且包含相同的消化抗性区，和(v)核苷酸，其适合于供给用于扩增所述待扩增的第一核酸序列；和(b)在允许消化、核酸外切酶消化和链移位聚合的条件下实现扩增反应，从而产生包含扩增量的所述第一核酸序列的产物混合物。本专利技术第一方面的扩增方法基于许多特征的组合。特别地，该方法利用(a)和(b)的相互关联的组合：(a)具有远离其5′-末端的消化抗性区的第一核酸引物,和(b)包含彼此杂交的第一和第二核酸链的双链核酸，所述第一链包含待扩增的核酸序列。该组合使得第一核酸链具有,从其5'-末端延伸的,与包括消化抗性序列的第一引物相同的核苷酸序列的5′-末端区。在该扩增方法中，核酸外切酶消化第一链的5′-末端区，但不通过该链的5′-末端区中的消化抗性区。结果，第二链的3′-末端暴露并提供用于第一引物杂交的位点，其中所述第一引物在与第二链的3′-末端杂交中移位第一链的5′-末端区的未消化部分。然后第一引物通过链移位聚合酶的作用被延伸以产生第一链的拷贝。然后新合成的第一链的5′-末端区可以(通过核酸外切酶)被消化，并且所述过程实际上自我重复。本专利技术的扩增方法优选在等温条件下进行，例如在45℃至55℃的温度下进行。因此，链移位聚合酶是能够在等温条件下复制模板链的聚合酶。类似地，核酸外切酶是能够在优选的等温条件下实现消化的核酸外切酶。用于本专利技术的优选链移位聚合酶是那些缺乏3′核酸外切酶活性的聚合酶。链移位聚合酶可以是Bst系列之一，尽管存在如下所述的其他可能性。核酸外切酶优选是识别双链核酸分子的平末端的核酸外切酶。特别优选核酸外切酶是λ-核酸外切酶，其以5'和3'方向逐步降解双链DNA的一条链，其优先顺序为双链结构末端的构型，即5'-凹陷的>平的>>5'-突出端，其对磷酸化而非羟基化末端优先10倍。在本专利技术的一个实施方案中，双链核酸分子的第二条链可以是“正常的”，因为它不具有消化抗性区。下面参考图1更详细地描述根据该实施例的过程。在本专利技术的该实施方案中，优选地所述第一链的5'-末端和第二链的3'-末端一起为所述双链核酸分子提供平末端。此外，优选地所述第一链的5'-末端具有5'-磷酸基团，并且所述核酸外切酶是，在扩增混合物中优先消化在其5'-末端具有磷酸(PO4)基团的双链核酸分子的链的核酸外切酶，所述消化从所述链的所述末端朝向其3'-末端，以释放第二链的3'-末端，用于引物与其杂交。在这样的实施方案中，优选地核酸外切酶是λ-核酸外切酶。在本专利技术的另一个实施方案中，该方法利用具有(如第一引物)远离其5'-末端的消化抗性区的第二核酸引物。此外，在该实施方案中，第二链具有从其5'-末端延伸的5'-末端区，其具有与第二引物相同的核苷酸序列(包括消化抗性序列)。下面参考附图的图3更详细地描述该实施方案。在该实施方案中，优选地双链核酸分子具有平末端。优选地，所述第一和第二链各自的5'-末端也具有5'-磷酸基团，并且所述核酸外切酶是，在扩增混合物中优先消化在其5'-末端具有磷酸(PO4)基团的双链核酸分子的链的核酸外切酶，所述消化从所述链的该末端朝向其3′-末端。优选地，核酸外切酶是λ-核酸外切酶。对于本专利技术的所有实施方案，含有待扩增序列的双链DNA分子可以从含有目的序列的天然存在的核酸链合成。天然存在的链可以是,例如存在于细菌或病毒中的链。天然存在的链可以是,例如rRNA链。下面参考附图的图5描述从rRNA链获得用于本专利技术方法的双链核酸构建体的程序。备选地，天然存在的链可以是DNA链。在这种情况下，待根据本专利技术的方法扩增的双链核酸分子可衍生自变性的基因组或质粒DNA(参见例如以下关于图6的描述)。对于本专利技术的所有实施方案，优选地第一引物(以及第二引物，如果利用的话)包含20至30个核苷酸。相应地，第一链的5′-末端区(和，如果利用的话，第二链的5′-末端区)具有20至30个核苷酸的长度。第一引物(和第二引物，如果利用的话)的消化抗性区优选地沿着引物的长度大约中间提供。因此，在该引物包含20个核苷酸的情况下，消化抗性区优选从自引物的5′-末端的约8-10个核苷酸开始。在引物包含30个核苷酸的情况下，消化抗性区优选从自5′-末端的约13至15个核苷酸开始。消化抗性区可以由至少一种抵抗核酸外切酶消化的核苷酸提供。优选地，消化抗性区包含多个(例如3至6个)经修饰核苷酸的连续序列。经修饰核苷酸可以是例如硫代磷酸酯核苷酸(即其中非桥接氧原子被硫取代的核苷酸)。如所表明的，优选地消化抗性区(例如包含3至6个经修饰核苷酸的连续序列)沿着1′引物(如果利用，2’也同样)大约中间存在。在这种情况下，特别优选地链移位聚合酶是缺乏3′核酸外切酶活性的聚合酶。然而，我们不排除消化抗性区延伸到引物的3′-末端的可能性，在这种情况下可采用具有3′核酸外切酶活性的链移位聚合酶(例如phi29)的使用。根据本专利技术方法产生的扩增序列可以，例如具有每条链50至150个碱基的长度。本专利技术的方法还可包含检测扩增序列的步骤。在本专利技术的一个优选实施例中，通过以下步骤实现检测：(i)在所述产物混合物中提供核酸报告子组合，所述核酸报告子组合包含(a)报告链，其具有与其结合的荧光报告子部分，该报告链能够与待检测的扩增核酸序列杂交，和(b)猝灭链，其能够与所述报告链杂交并具有猝灭剂部分，所述猝灭剂部分猝灭所述荧光报告子部分的荧光，(ii)使所述产物混合物经历变性和之后的再杂交条件，以及(iii)检测所述荧光报告子部分的存在。在该检测方法的步骤2(ii)中，将产物混合物相继地经历变性以及之后的再杂交条件。在变性条件下，报告链和猝灭链是产物混合物中的单独链。在再杂交条件下，报告链能够与扩增的核酸序列杂交，而不是与猝灭链杂交。因此，再杂交步骤后的荧光证实了扩增序列的存在。通常，与报告链相比，猝灭链将以摩尔过量存在。猝灭剂链与报告链的摩本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.扩增核酸序列的方法，其包括：(a)提供扩增混合物，所述扩增混合物包含：(i)能够实现双链核酸分子的链的消化的核酸外切酶，所述消化从所述链的5′‑末端朝向3′‑末端，(ii)链移位聚合酶，(iii)双链核酸分子，其包含彼此杂交的第一和第二核酸链，包含待扩增的第一核酸序列并具有远离其5′‑末端的第一5′‑末端区的所述第一链具有抵抗通过如(i)所定义的所述核酸外切酶的消化(在该方法的条件下)的核苷酸序列，(iv)第一核酸引物，其具有与所述第一核酸的第一末端区相同的核苷酸序列，并且包含相同的消化抗性区，和(v)核苷酸，其适合于供给用于扩增所述待扩增的第一核酸序列；和(b)在允许消化、核酸外切酶消化和链移位聚合的条件下实现扩增反应，从而产生包含扩增量的所述第一核酸序列的产物混合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.14 GB 1617491.41.扩增核酸序列的方法，其包括：(a)提供扩增混合物，所述扩增混合物包含：(i)能够实现双链核酸分子的链的消化的核酸外切酶，所述消化从所述链的5′-末端朝向3′-末端，(ii)链移位聚合酶，(iii)双链核酸分子，其包含彼此杂交的第一和第二核酸链，包含待扩增的第一核酸序列并具有远离其5′-末端的第一5′-末端区的所述第一链具有抵抗通过如(i)所定义的所述核酸外切酶的消化(在该方法的条件下)的核苷酸序列，(iv)第一核酸引物，其具有与所述第一核酸的第一末端区相同的核苷酸序列，并且包含相同的消化抗性区，和(v)核苷酸，其适合于供给用于扩增所述待扩增的第一核酸序列；和(b)在允许消化、核酸外切酶消化和链移位聚合的条件下实现扩增反应，从而产生包含扩增量的所述第一核酸序列的产物混合物。2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一链的5'-末端和第二链的3'-末端一起为所述双链核酸分子提供平末端。3.如权利要求2所述的方法，其中所述第一链的5'-末端具有5'-磷酸基团，并且所述核酸外切酶是，在扩增混合物中优先消化在其5'-末端具有磷酸(PO4)基团的双链核酸分子的链的核酸外切酶，所述消化从所述链的该末端朝向其3'-末端。4.如权利要求3所述的方法，其中所述核酸外切酶是λ-核酸外切酶。5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一末端区和所述第一引物的消化抗性区各自包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸。6.如权利要求5所述的方法，其中所述第一末端区和所述第一引物的消化抗性区各自包含多个硫代磷酸酯核苷酸的连续序列。7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述第一末端区的消化抗性区位于其末端的中间，和相应地，所述第一引物的消化抗性区位于其末端的中间。8.如权利要求1所述的方法，其中所述第二核酸链具有其远离其5'-末端的第二5'-末端区，具有抵抗通过如(i)所定义的所述核酸外切酶的消化(在该方法的条件下)的核苷酸序列，并且所述扩增混合物包含与第二核酸链的所述第二末端区相同的第二引物。9.如权利要求8所述的方法，其中所述双链核酸分子具有平末端。10.如权利要求9所述的方法，其中所述第一和第二链各自的5'-末端具有5'-磷酸基团，并且所述核酸外切酶是，在扩增混合物中优先消化在其5'-末端具有磷酸(PO4)基团的双链核酸分子的链的核酸外切酶，所述消化从所述链的该末端朝向其3'-末端。11.如权利要求10所述的方法，其中所述核酸外切酶是λ-核酸外切酶。12.如权利要求8至11中任一项所述的方法，其中所述第一末端区、所述第一引物、所述第二末端区和所述第二引物的消化抗性区各自包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸。13.如权利要求12所述的方法，其中所述第一末端区、所述第一引物、所述第二末端区和所述第二引物的消化抗性区各自包含多个硫代磷酸酯核苷酸的连续序列。14.如权利要求8至13中任一项所述的方法，其中所述第一末端区和第二末端区的消化抗性区位于其末端的中间，和相应地，所述第一引物和所述第二引物的消化抗性区位于其末端的中间。15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其额外包括检测扩增序列。16.如权利要求15所述的方法，其中通过以下步骤实现检测：(i)在所述产物混合物中提供核酸报告子组合，所述核酸报告子组合包含(a)报告链，其具有与其结合的荧光报告子部分，该报告链能够与待检测的扩增核酸序列杂交，和(b)猝灭链，其能够与所述报告链杂交并具有猝灭剂部分，所述猝灭剂部分猝灭所述荧光报告子部分的荧光，(ii)使所述产物混合物经历变性和之后的再杂交条件，和(iii)检测所述荧光报告子部分的存在。17.如权利要求16所述的方法，当直接或间接地从属于权利要求8-15中任一项时，用于扩增淋病奈瑟氏球菌(NeisseriaGonorrhoeae)中的核酸序列，其中所述双链核酸分子具有图8中所示的碱基序列，所述第一引物具有碱基序列：5′-GAACGCTGGCGGCATGCTTTACAC-3’，所述第二引物具有碱基序列：5'-CCCGGTACGTTCCGATATGTTACTCACC-3’，所述报告链具有碱基序列：5'CY5GCAAGTCGGACGGCAGCACAGGGAAGCTTGCTTCTCGGGTGGCGAGTGGCGAACG-3′，和所述猝灭链具有碱基序列：5′-AGAAGCAAGCTTCCCTGTGCTGCCGTCCGACTTGC-3’。18.确定生物样品中靶核酸序列的存在与否的方法，该方法包括以下步骤：(a)在下述条件下，处理所述生物样品，以便由此产生衍生物样品，所述条件为：如果所述靶核酸存在于所述生物样品中，则在所...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔尔乔斯·派特索斯，斯蒂芬·约翰·敏特，
申请(专利权)人：雷沃卢金有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB