Cry1A微流控芯片检测的引物、方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及用于农产品中转基因成分Cry1A检测的寡核苷酸引物。本发明专利技术还涉及用于测定农产品中转基因成分Cry1A的环介导等温扩增检测方法，所述方法包括使用针对农产品中转基因成分Cry1A的特异性寡核苷酸引物。本发明专利技术还涉及用于快速检测农产品中转基因成分Cry1A的环介导等温扩增微流控芯片检测试剂盒，所述试剂盒包括用于环介导等温扩增检测农产品中转基因成分Cry1A的特异性寡核苷酸引物。本发明专利技术还涉及针对农产品中转基因成分Cry1A的特异性寡核苷酸引物在检测农产品中转基因成分中的应用。使用本发明专利技术的环介导等温扩增检测方法和试剂盒，能够特异、灵敏、准确地测定大豆、玉米、大米、棉花、油菜及其加工品等样品中是否含有转基因成分Cry1A。

Primers, Methods and Kits for Cry1A Microfluidic Chip Detection

【技术实现步骤摘要】
Cry1A微流控芯片检测的引物、方法和试剂盒
本专利技术属于生物
，具体而言，本专利技术涉及用于农产品中转基因成分Cry1A检测的寡核苷酸引物，用于测定农产品中转基因成分Cry1A的环介导等温扩增检测方法，用于快速检测农产品中转基因成分Cry1A的环介导等温扩增微流控芯片检测试剂盒以及农产品中转基因成分Cry1A的特异性寡核苷酸引物在检测农产品中转基因成分Cry1A时的应用。
技术介绍
转基因作物：现代生物技术以其方便、快速、准确等特点，从基因水平分析原料和产品的来源与特性，特异性强、灵敏度高，在农产品转基因检测中得到了广泛应用。但是，环介导等温扩增微流控芯片检测技术在农产品转基因检测中的应用较少。目前，国内外尚未见报道能够快速、简便、特异且灵敏地检测大豆、玉米、大米、棉花、油菜及其加工品中转基因成分的环介导等温扩增微流控芯片检测方法和试剂盒。因此，本领域需要一种快速、特异性好、灵敏度高，微量体系，多个指标通量的农产品中转基因成分的检测方法，进行大豆、玉米、大米、棉花、油菜种子及其加工品中转基因成分的检测。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于，提供准确检测农产品中转基因成分Cry1A的特异性寡核苷酸引物。本专利技术的另一个目的在于，提供准确测定农产品中转基因成分Cry1A的环介导等温扩增微流控芯片检测方法。本专利技术的另一个目的在于，提供准确测定农产品中转基因成分Cry1A的环介导等温扩增微流控芯片检测试剂盒。本专利技术的还一个目的在于，提供农产品中转基因成分Cry1A的特异性寡核苷酸引物在准确检测农产品中转基因成分中的应用。针对上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术的专利技术人根据基因Cry1A设计了能特异性鉴别农产品中转基因元件Cry1A的寡核苷酸引物组，能从样品DNA中高效特异扩增出一段较短的Cry1A特异性基因片段。根据本专利技术的一个实施方案，本专利技术提供用于环介导等温扩增方法检测农产品中转基因成分的特异性寡核苷酸引物组，所述引物组是根据Cry1A基因序列在类似序列中具有差异性的特点而设计的。所述引物组由外引物、内引物、环引物组成，所述外引物1为GAGCAGCTGATCAACCAGCGGATCGA（SEQIDNo.1），所述外引物2为GGAACTTGGTAGTTCTGGACTGCGA（SEQIDNo.2）；所述内引物1为TCGGCTTCCCACTCTCGGAAGAGTTCGCCAGGAACCAGGCCATC（SEQIDNo.3），所述内引物2为AACCCAGCCCTCCGCGAGGATAGCTGTGGTCAAGGCGCTGTTC（SEQIDNo.4）；所述环引物1为CTCTGCGTAGATTTGGTAGAGATTGCT（SEQIDNo.5），所述环引物2为ATGCGTATCCAATTCAACGACAT（SEQIDNo.6）。在一个实施方案中，本专利技术提供的Cry1A特异性检测组合物，所述组合物包含特异性寡核苷酸引物组。在一个优选的实施方案中，本专利技术提供了用于环介导等温扩增方法定性检测农产品中转基因成分的组合物，所述组合物包含Cry1A特异性寡核苷酸引物组，其中所述Cry1A特异性引物组由外引物、内引物、环引物组成，所述外引物的碱基序列为SEQIDNo.1、SEQIDNo.2，所述内引物的碱基序列为SEQIDNo.3、SEQIDNo.4，所述环引物的碱基序列为SEQIDNo.5、SEQIDNo.6。所述的环介导等温扩增条件为65℃，60min。根据本专利技术的另一个实施方案，本专利技术提供用于准确定性检测农产品中转基因成分的试剂盒，所述试剂盒包括本专利技术用于环介导等温扩增方法检测农产品中转基因成分的特异性寡核苷酸引物组以及探针和使用说明书。在本专利技术的试剂盒优选实施方案中，本专利技术的农产品中转基因成分定性检测特异性寡核苷酸引物组是根据Cry1A基因序列在类似序列中具有差异性的特点而设计的。在一个实施方案中，所述试剂盒的Cry1A特异性寡核苷酸引物组由外引物、内引物、环引物组成，所述外引物的碱基序列为SEQIDNo.1、SEQIDNo.2，所述内引物的碱基序列为SEQIDNo.3、SEQIDNo.4，所述环引物的碱基序列为SEQIDNo.5、SEQIDNo.6。在优选的实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于快速检测农产品中转基因成分的环介导等温扩增条件的描述。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的说明书中给出的PCR扩增条件是65℃，60min。在一个具体的实施方案中，本专利技术用于农产品中转基因成分定性检测的试剂盒还包括对照品。对照品包括阴性对照品和阳性对照品。在一个实施方案中，阳性对照为含有靶基因序列的质粒DNA。本专利技术以Cry1ADNA为检测基础，根据Cry1A基因序列在类似序列中具有差异性的特点，比对分析了Cry1A基因序列。根据这些序列设计引物，利用环介导等温扩增法定性检测样品中的农产品中转基因成分。本专利技术的环介导等温扩增检测方法采用完全闭管检测，无需扩增产物后处理，避免了交叉污染和假阳性。本专利技术的方法巧妙地运用了环介导等温扩增技术的DNA高效扩增、特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。本专利技术的按照引物序列制成的试剂盒，用于此类产品的定性检测，具有灵敏度高、特异性强、结果稳定可靠且避免交叉污染造成假阳性的优点。使用本专利技术的环介导等温扩增检测方法和微流控芯片检测试剂盒，可用于定性检测，其简单、快速、特异且灵敏的特点适合用于国内外市场上大豆、玉米、大米、棉花、油菜及其加工品等样品中农产品中转基因成分的检测等。附图说明图1管式扩增中引物特异性检测结果图中显示环介导等温扩增特异性检测Cry1A的结果，其中使用特异性寡核苷酸引物组SEQIDNo.1-6检测，其中基线上方为阳性样品的扩增曲线，基线下方为大豆、玉米、小麦、大米、马铃薯、番茄、黑豆、蚕豆、油菜、白菜、绿豆、芝麻、芋头、黄瓜、香菇、红薯（市场随机购买制备）等样品及空白对照（无菌双蒸水）。图2管式扩增中引物灵敏度检测结果图中显示是对环介导等温扩增特异性检测转基因成分的绝对灵敏度进行评价，将转基因DNA浓度依次梯度稀释，反应终浓度依次为5ng/μL、4ng/μL、3ng/μL、2ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL以及空白对照（无菌双蒸水）。图3管式扩增中引物检出限检测结果图中显示是对环介导等温扩增特异性检测转基因成分的相对灵敏度进行评价，使用购买标准品或将阳性样品和阴性对照混合，使转基因成分含量的质量比分别为100%、50%、10%、5%、1%、0.1%及0.01%。图4芯片扩增引物包埋浓度比例针对引物扩增体系灵敏度的特点，结合所使用的酶等反应试剂对引物的要求以及芯片本身的生物特性，采用两种浓度比例进行实验，引物包埋比例如表1所示。芯片中两组重复在对应反应池均出现“S”形扩增曲线，并且出峰时间，峰形等均一致，则说明所包埋引物浓度比例适合Cry1A引物的筛选优化（a图为碟片I，b图为碟片II）。表1.引物包埋比例图5芯片扩增中引物特异性结果a图显示的是环介导等温扩增特异性检测Cry1A的在碟片反应中的结果，其中所使用特异性寡核苷酸引物组SEQIDNo.1-6先包埋固定于碟本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于环介导等温扩增方法检测农产品中转基因成分的特异性寡核苷酸引物组合物，其中所述引物组为:

【技术特征摘要】
1.用于环介导等温扩增方法检测农产品中转基因成分的特异性寡核苷酸引物组合物，其中所述引物组为:。2.通过环介导等温扩增方法检测农产品中转基因成分的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-2所述的引物组合物和使用说明书。3.准确检测农产品中转基因成分的环介...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈颖，黄文胜，邓婷婷，韩建勋，王娉，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11