本发明专利技术公开了一种快速检测鸭疫里默氏杆菌的RPA试剂盒及其检测方法。该试剂盒包含：含RPA冻干颗粒的反应管，反应缓冲液，醋酸镁，一对引物及一条探针。实验证明本发明专利技术的试剂盒灵敏度和特异性与qPCR法相当，整个反应时间在15min内完成，检测结果仅需要通过荧光曲线改变来判定。因此，本发明专利技术试剂盒具有快捷、高效、灵敏等优点，不仅为有效检测和鉴定鸭疫里默氏杆菌提供了技术手段，而且操作简便、快速，适用于临床兽医现场诊断和对鸭疫里默氏杆菌的科学研究。
RAPA Kit for Rapid Detection of Riemerella duck pestis and Its Application
【技术实现步骤摘要】
一种快速检测鸭疫里默氏杆菌的RPA试剂盒及其用途
本专利技术属于预防兽医学检验具体领域，涉及一种检测鸭疫里默氏杆菌的试剂盒及其用途，特别涉及一种快速检测鸭疫里默氏杆菌的RPA检测试剂盒及其用途。
技术介绍
鸭疫里默氏杆菌(Riemerellaanatipestifer，RA)是革兰氏阴性短杆菌，可感染家鸭、鹅、雉鸡、火鸡、天鹅等(Glünder&Hinz,1989；Helfer&Helmboldt,1977)，自然条件下以家鸭最易感。本病可经消化道、呼吸道、皮肤伤口等多种途径感染，尤以脚蹼伤口最易感。家鸭(1-8周龄多见)感染后，可表现典型的纤维素性炎症，如纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎等，部分慢性感染表现出神经症状和生长障碍等临床特征(LeavittS&AyroudM,1997)。自1904年Rimer首次报道由RA引起鹅的“渗出性败血症”(Riemer,1904)和1933年Hendrickson和Hilbert从纽约长岛病死鸭体内成功分离和鉴定到病原菌Pfeifferellaanatipestifer(Hendrickson&Hilbert,1933)以来，英国、西班牙、泰国、日本、中国等国相继报道了该病的发生，因此本病呈世界各地分布，具有较高的发病率和死亡率，鸭场一旦感染后就很难彻底清除，并且易合并大肠杆菌和沙门氏菌感染，是引起养鸭业重大经济损失的传染病之一。在我国鸭群中，RA广泛存在且血清型复杂，郭玉璞于1982年首次报道了RA血清1型的流行(郭玉璞等，1982)，此后，高福、程安春等鉴定的RA分离株均为血清1型(高福等，1987，程安春等，1996)。直到1997年，张大丙等分离鉴定到7个不同的血清型，包括血清2、6、10、11、13、14型。此后，程安春等(2003)又鉴定出16种血清型，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、14，以及其他4个新的血清型，如22、23、24、25。疫苗免疫是现阶段较为普遍的预防措施，但是由于各型疫苗之间缺乏交叉保护，因此很多鸭场不推荐使用；另外，由于RA菌株之间的耐药性和致病力差异，抗生素治疗也不能从根本上清除RA。因此，严格的生物安全措施和鸭场定期监测能够避免RA的传播和感染。目前为止，检测RA的方法包括：细菌分离培养、血清学抗体检测及分子基因诊断，其中分离培养是诊断RA的金标准，但需要无菌采集心、肝、脑等病料，配置TSA培养基，在含CO2的环境中生长24-48h，只适用于实验室检测；血清学检测如平板凝集试验和琼脂扩散试验，这两种方法均涉及制备抗原的菌株来源问题，具有灵敏度低、特异性差、结果判断主观性强和不适合大批量检测等特点，限制了它们在临床中的广泛应用。ELISA诊断(刘爽等，2009；吴彩艳等，2009；季慕寅等，2015；高群，2015)用的抗原多以灭活的全菌体、超声波破碎菌体后的裂解物、脂多糖，重组的蛋白较多，但绝大多数报道仅仅初步建立了ELISA方法，并没有进一步对所建立的方法进行优化，也没有开展临床试验及验证ELISA方法的实际应用效果。分子诊断方法，如根据RA主要外膜蛋白基因设计特异性引物，用常规或多重PCR方法扩增RA的特异性目的片段，可确诊RA的存在(胡清海等，2002)；虽然该方法特异性高，敏感性强，但需要用核酸电泳对扩增产物进行检测，增加了污染的可能性，不易基层推广。尽管环介导等温扩增方法(LAMP)具有更高的特异性和敏感性(吴彤等，2016)，并且耗时短，结果判定直观，不需特殊仪器设备，但该方法需要设计三对引物，增加了试验设计的难度，且扩增出很多条带，存在非特异性扩增，另外加样环境要求严格，模板易污染。因此，建立能够快速、特异检测RA抗原的试剂盒，实现快速诊断和基层推广，控制好RA的发生及流行，对减少养鸭业经济损失和提高经济效益具有重要的现实意义。RPA技术是由以英国剑桥Babraham研究院建立的并由TwistDx生物技术公司专利技术的(http://www.twistdx.co.uk/)。该技术以T4噬菌体的核酸复制机制为原理，反应所需原料有T4噬菌体编码的重组酶蛋白uvsX和uvsY、单链结合蛋白gp32、DNA聚合酶以及寡聚核苷酸；同时还需要引物、探针、模板、ddH2O和Mg2+等。该技术基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟生物体内DNA复制，在常温下即可对目标片段进行等温扩增，摆脱了对热循环仪器的要求，可在短时间内快速扩增出目的片段，具有简便，快速，灵敏等优点。目前RPA技术已经在一系列病原微生物的分子检测中得到应用，如结核分枝杆菌、口蹄疫病毒、犬细小病毒、非洲猪瘟等。但据我们所知，国内外未见RPA技术在RA中的应用。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的问题，针对鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白OMPA基因，建立并评估了基于RPA的快速诊断试剂盒，该试剂盒能够快速、特异、简单的鉴定鸭疫里默氏杆菌，实现快速诊断的目的，能够用于鸭疫里默氏杆菌的科学研究。为实现本专利技术的专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术根据鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白OMPA基因设计引物和探针；通过NCBI中的Blast软件比对分析发现，该基因在GenBank中上传的不同血清型鸭疫里默氏杆菌之间具有高度的保守性；实验室通过测序发现该基因在临床不同分离株中均存在。因此本专利技术选取该基因全长中的一段(334bp-534bp)作为目的片段设计引物和探针，以期能够检测到尽可能多的鸭疫里默氏杆菌。针对RPA的检测特点，本专利技术分别设计合成了三对上游引物和一条下游引物，通过对引物与探针组合进行扩增效果评价，最终选出能产生强扩增信号的引物与探针组合应用到本专利技术中。所有的引物和探针都由金斯瑞(南京，中国)合成。本专利技术提供一种快速检测鸭疫里默氏杆菌的RPA试剂盒，所述试剂盒中包含：含RPA冻干颗粒的反应管，反应缓冲液、醋酸镁以及ddH2O；还包括一对引物及一条探针，所述引物对和探针如下：上游引物：5’-GCTAACTTTTGGCAAGCGTC-3’下游引物：5’-GGTTTGTACTGGTCCTGCTAC-3’探针：5’-TGGAACACC[dT-Fam]G[dSpacer]T[dT-BHQ1]CACCATCTGTATCTG[C3-Spacer]-3’。所述的探针序列中具有荧光基团FAM和猝灭基团BHQ1，两个基团之间由dSpacer隔开，3’端由C3Spacer修饰。所述RPA冻干颗粒(TwistDxexokit,Cambridge,UnitedKingdom)包含噬菌体重组酶UvsX，辅助因子UvsY，DNA聚合酶，单链DNA结合蛋白，dNTPS。所述反应缓冲液为RehydrationBuffer。作为优选，所述上游引物、下游引物和探针在所述RPA试剂盒中的终浓度为10μM。作为优选，所述试剂盒的50μL反应体系如下：29.5μL的反应缓冲液，10μM上下游引物各2μL，10μM探针0.5μL，ddH2O11.5μL，鸭疫里默氏杆菌DNA模板或标准质粒2μL，以及2.5μL280mmol/L的醋酸镁溶液。本专利技术还提供上述RPA在检测鸭疫里默氏杆菌中的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的。本专利技术还提供上述鸭疫里默氏杆菌的检测方法本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种快速检测鸭疫里默氏杆菌的RPA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包含：含RPA冻干颗粒的反应管，反应缓冲液、醋酸镁以及ddH2O；还包括一对引物及一条探针，所述引物对和探针如下：上游引物：5’‑GCTAACTTTTGGCAAGCGTC‑3’下游引物：5’‑GGTTTGTACTGGTCCTGCTAC‑3’探针：5’‑TGGAACACC[dT‑Fam]G[dSpacer]T[dT‑BHQ1]CACCATCTGTATCTG[C3‑Spacer]‑3’。
【技术特征摘要】
1.一种快速检测鸭疫里默氏杆菌的RPA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包含：含RPA冻干颗粒的反应管，反应缓冲液、醋酸镁以及ddH2O；还包括一对引物及一条探针，所述引物对和探针如下：上游引物：5’-GCTAACTTTTGGCAAGCGTC-3’下游引物：5’-GGTTTGTACTGGTCCTGCTAC-3’探针：5’-TGGAACACC[dT-Fam]G[dSpacer]T[dT-BHQ1]CACCATCTGTATCTG[C3-Spacer]-3’。2.根据权利要求1所述的RPA试剂盒，其特征在于：所述上游引物、下游引物和探针在所述RPA试剂盒中的终浓度为10μM。3.根据权利要求1所述的RPA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的50μL反应体系如下：29.5μL的反应缓冲液，10μM上下游引物各2μL，10μM探针0.5μL，d...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑福英，宫晓炜，陈启伟，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62
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