一种chIRF3荧光定量RT-PCR的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种chIRF3荧光定量RT‑PCR的检测方法，包括引物设计、总RNA提取、chIRF3基因的扩增、扩增产物与pUC‑T载体连接构建质粒标准品、荧光定量RT‑PCR扩增体系与条件、灵敏性、重复性、特异性试验、传染性法氏囊病病毒感染三黄鸡的chIRF3检测。本试验根据chIRF3基因序列设计引物，先用普通PCR方法扩增出目的片段，chIRF3片段大小为146bp，以扩增的片段和质粒的重组体为标准品再进行荧光定量PCR检测，评价本方法的性能。建立起的标准曲线的相关系数非常接近于1，熔融曲线显示成单一峰，无非特异性扩增与引物二聚体出现，建立的检测体系可以稳定灵敏地检测到最低1×10

Detection of chIRF3 by fluorescence quantitative RT-PCR

【技术实现步骤摘要】
一种chIRF3荧光定量RT-PCR的检测方法
本专利技术涉及一种chIRF3荧光定量RT-PCR的检测方法，尤其涉及一种灵敏度高、特异性强、重复性好的chIRF3荧光定量RT-PCR的检测方法。
技术介绍
干扰素调节因子IRF是一种由生物体的淋巴细胞和单核细胞在机体受到病毒或其他诱生剂的作用时产生的分泌性可溶糖蛋白，IRF家族包括有IRF1，IRF3，IRF7，IRF9等转录因子，参与广泛的生物学过程，包括先天免疫反应，在不同的免疫通路中担任着调控干扰素表达的作用。鸡源IRF3(chIRF3)因子作为干扰素因子家族的一员具有调节Ⅰ型干扰素基因表达的关键转录因子，chIRF-3存在很多活性细胞中，当受到病毒感染信号时chIRF3被磷酸化激活，进入细胞核中与转录因子结合诱导IFNa/β的表达，起到免疫调节作用。研究chIRF3因子的表达的方法有很多，Western-Blot研究chIRF3蛋白表达，QPCR检测chIRF3核酸扩增表达等，实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中添加一种荧光基团实时监测到荧光信号的反应变化，描绘成一条标准曲线，推算出该样品的起始拷贝数。近年来，实时荧光定量PCR技术检测方法被广泛运用于动植物基因工程，微生物和医学领域中取得广泛的运用。PCR检测手段主要有探针类和染料类2大类。染料类PCR技术中例如SYBRGreenⅠ能与双链分子DNA小沟进行结合，后DNA分子的物理化学特征就会发生改变，从而能够发光，发光的强度能将扩增产物进行放大。本实验将通过chIRF3基因的扩增与克隆，运用实时荧光定量RT-PCR法检测chIRF3标准品质粒，建立标准曲线，并运用于真核细胞的chIRF3的检测。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种chIRF3荧光定量RT-PCR的检测方法，具有灵敏度高、特异性强、重复性好的特点。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案为：一种chIRF3荧光定量RT-PCR的检测方法，其创新点在于，所述chIRF3荧光定量RT-PCR的检测方法包括如下步骤：步骤1：引物设计，引物序列：chIRF-3-F:5′-ACCACATGCAGACAGACTGACACT-3′；chIRF-3-R:5′-GGAGTGGATGCAAATGCTGCTCTT-3′；步骤2：总RNA提取，采集3周龄SPF鸡外周血加等体积PBS稀释，取稀释外周血加入鸡淋巴细胞分离液液面上离心后吸出淋巴细胞层，PBS洗涤两次取细胞悬液离心收集细胞，加入TRLzon提取总RNA；步骤3：chIRF3基因的扩增，总RNA按cDNA第一链合成试剂盒配制反应液，反应程序合成cDNA，以cDNA作为模板，进行PCR扩增，同时用超纯水作为空白对照进行PCR扩增；步骤4：扩增chIRF3片段与pUC-T载体构建重组质粒，扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收PCR产物，将纯化PCR产物与pUC-T载体根据QuickDNALigationKit快速DNA连接试剂盒来连接，取4μL连接产物转化入50μL的大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过蓝白斑试验筛选，PCR法鉴定，测序来确定；步骤5：标准品的制备，提取鉴定好的质粒作为标准品，测定其OD260与OD280值，计算其浓度与拷贝数，10倍梯度连续稀释至102copies/μL后作为标准品模板，采用荧光定量PCR法扩增，配置PCR反应体系；步骤6：灵敏性、重复性、特异性试验，将chIRF3标准质粒进行10倍梯度连续稀释至102copies/μL进行荧光定量PCR法扩增检测灵敏和特异性，使用1×106copies/μL进行组内组间重复性试验；步骤7：IBDV感染三黄鸡的chIRF3的动态表达检测，试验体三黄鸡经点眼、滴鼻法攻毒0.2ml，104.5ELD50/0.2ml的IBDVNN1172株，于攻毒后第1，3，7天取法氏囊，按步骤3提取总RNA逆转录成cDNA，通过检测免疫器官法氏囊的囊指数、病毒载量，确定IBDV攻毒成功；使用建立好chIRF3荧光定量RT-PCR方法检测感染IBDV鸡法氏囊chIRF3的动态表达。优选的，所述步骤②中采集3周龄SPF鸡外周血采用等体积PBS稀释，取2ml稀释血加入5ml鸡淋巴细胞分离液液面上，离心后吸出淋巴细胞层，PBS洗涤两次并将淋巴细胞密度调整为106/ml，取1ml细胞悬液离心收集细胞，加入1ml的TRLzon提取总RNA。优选的，所述步骤③中逆转录cDNA配制反应液中，以42℃，30min；85℃，5min的反应程序合成cDNA。优选的，所述步骤③中PCR扩增，25μL的反应体系：12.5μL的2×TaqMix，8.5μL的H2O，chIRF-3-F和chIRF-3-R各加1μL，cDNA模2μL；PCR反应参数设置为：94℃，预变性2min；94℃，30s；60℃，30s；72℃，1min共35个循环，反应延伸72℃，10min。优选的，所述步骤③中PCR对照扩增，25μL的反应体系：12.5μL的2×TaqMix，8.5μL的H2O，chIRF-3-F和chIRF-3-R各加1μL，2μL的ddH2O。优选的，所述步骤⑤中荧光定量RT-PCR反应体系，10μL的SYBRPremixExTaqⅡ，0.8μL浓度为10μmol/L的chIRF3-F，0.8μL浓度为10μmol/L的chIRF3-R，6μL的ddH2O，0.4μL的ROXReferenceDye，2μL的模DNA；反应程序中预变性95℃，30s，变性95℃，5s，退火60℃，30s共40个循环，熔融曲线95℃，15s，60℃，60s，95℃，15s。本专利技术的优点在于：本试验根据chIRF3基因序列设计引物，先用普通PCR方法扩增出目的片段，chIRF3片段大小为146bp，测序鉴定无误后制作成质粒标准品，扩增的片段和质粒构建成标准品再进行荧光定量PCR检测，评价本方法的性能。建立起的标准曲线的相关系数R2＝0.997，扩增效率E＝103.363％，都非常接近于1，熔融曲线显示成单一峰，无非特异性扩增与引物二聚体出现，建立的检测体系可以稳定灵敏的检测到最低1×102copies/μL。组间及组内重复性试验结果显示其变异系数均在0.5％以下，本试验成功建起了鸡chIRF3水平实时荧光定量检测方法，该法快速、灵敏，特异性与稳定性良好，为快速鉴定相关基因的转录水平及先天免疫调节机制的研究奠定基础。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1是本专利技术一种chIRF3荧光定量RT-PCR的检测方法中chIRF3PCR扩增电泳图。图2是本专利技术一种chIRF3荧光定量RT-PCR的检测方法中重组质粒chIRF3扩增电泳图。图3是本专利技术一种chIRF3荧光定量RT-PCR的检测方法中chIRF3扩增曲线与标准曲线。图4是本专利技术一种chIRF3荧光定量RT-PCR的检测方法中chIRF3熔融曲线。图5是本专利技术一种chIRF3荧光定量RT-PCR的检测方法中灵敏度试验。图6是本专利技术一种chIRF3荧光定量RT-PCR的检测方法中组内和组间重复性试验。图7是本专利技术一种chIRF3荧光定量RT-PCR的检测方法中免疫器官指数检测图。图8是本专利技术一种chIR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种chIRF3荧光定量RT‑PCR的检测方法，其特征在于，所述chIRF3荧光定量RT‑PCR的检测方法包括如下步骤：步骤1：引物设计，引物序列：chIRF‑3‑F:5′‑ACCACATGCAGACAGACTGACACT‑3′；chIRF‑3‑R:5′‑GGAGTGGATGCAAATGCTGCTCTT‑3′；步骤2：总RNA提取，采集3周龄SPF鸡外周血等体积PBS稀释，取稀释外周血加入鸡淋巴细胞分离液液面上离心后吸出淋巴细胞层，PBS洗涤两次取细胞悬液离心收集细胞，加入TRLzon提取总RNA；步骤3：chIRF3基因的扩增，总RNA按cDNA第一链合成试剂盒配制反应液，反应程序合成cDNA，以cDNA作为模板，进行PCR扩增，同时用水作为空白对照进行PCR扩增；步骤4：扩增chIRF3片段与pUC‑T载体构建重组质粒，扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收PCR产物，将纯化PCR产物与pUC‑T载体根据Quick DNA Ligation Kit快速DNA连接试剂盒来连接，取4ul连接产物转化入50ul的大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过蓝白斑试验筛选，PCR法鉴定，测序来确定；步骤5：标准品的制备，提取鉴定好的质粒作为标准品，测定其OD260与OD280值，计算其浓度与拷贝数，10倍梯度连续稀释至10...

【技术特征摘要】
1.一种chIRF3荧光定量RT-PCR的检测方法，其特征在于，所述chIRF3荧光定量RT-PCR的检测方法包括如下步骤：步骤1：引物设计，引物序列：chIRF-3-F:5′-ACCACATGCAGACAGACTGACACT-3′；chIRF-3-R:5′-GGAGTGGATGCAAATGCTGCTCTT-3′；步骤2：总RNA提取，采集3周龄SPF鸡外周血等体积PBS稀释，取稀释外周血加入鸡淋巴细胞分离液液面上离心后吸出淋巴细胞层，PBS洗涤两次取细胞悬液离心收集细胞，加入TRLzon提取总RNA；步骤3：chIRF3基因的扩增，总RNA按cDNA第一链合成试剂盒配制反应液，反应程序合成cDNA，以cDNA作为模板，进行PCR扩增，同时用水作为空白对照进行PCR扩增；步骤4：扩增chIRF3片段与pUC-T载体构建重组质粒，扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收PCR产物，将纯化PCR产物与pUC-T载体根据QuickDNALigationKit快速DNA连接试剂盒来连接，取4ul连接产物转化入50ul的大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过蓝白斑试验筛选，PCR法鉴定，测序来确定；步骤5：标准品的制备，提取鉴定好的质粒作为标准品，测定其OD260与OD280值，计算其浓度与拷贝数，10倍梯度连续稀释至102copies/μL后作为标准品模板，采用荧光定量PCR法扩增，配置PCR反应体系；步骤6：灵敏性、重复性、特异性试验，将chIRF3标准质粒进行10倍梯度连续稀释至102copies/μL进行荧光定量PCR法扩增检测灵敏和特异性，使用1x106copies/μL进行组内组间重复性试验；步骤7：IBDV感染三黄鸡的chIRF3的动态表达检测，试验体三黄鸡经点眼、滴鼻法攻毒0.2ml，104.5ELD50/0.2ml的IBDVNN1172株，于攻毒后第1，3，7天取法氏囊，按步骤2提取总RNA、按步骤3逆转录成cDNA，通过检测免疫器官法氏囊的囊指数、病毒载量，确定IBDV攻毒成功；使用建立好...

【专利技术属性】
技术研发人员：何秀苗，陈艳艳，刘玉晶，黄海佩，李尚泉，陈博文，沈巍巍，
申请(专利权)人：广西民族大学，
类型：发明
国别省市：广西,45