用于空间标记和分析生物样本中的核酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于空间标记生物样本中的核酸分子的方法，并且具体地涉及一种方法，其包括：(a)提供其上固定有多种捕获探针的固体基质，使得每种捕获所述固体基质上的不同位置，其中所述探针用于引物延伸反应并且其中每种所述捕获探针包含核酸分子，所述核酸分子包含：(i)用于从固体基质表面释放捕获探针的裂解结构域，(ii)对应于捕获探针在固体基质上的位置的定位结构域，和(iii)捕获结构域；(b)使所述固体基质与生物样本接触；和(c)在允许生物样本的核酸与所述捕获探针中的捕获结构域杂交的条件下从所述固体基质的表面释放所述捕获探针并且同时和/或随后使用与捕获探针杂交的核酸分子作为延伸模板延伸捕获探针以产生延伸探针，从而空间标记生物样本的核酸；其中步骤(c)包括使所述固体基质与含水反应混合物接触，所述含水反应混合物包含：(i)能够使用与捕获探针杂交的核酸分子作为延伸模板延伸所述捕获探针的聚合酶；和(ii)用于从固体基质表面释放所述捕获探针的工具。

A Method for Spatial Marking and Analysis of Nucleic Acids in Biological Samples

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于空间标记和分析生物样本中的核酸的方法
本专利技术总体涉及在生物样本中核酸分子的空间标记，例如，生物样本(例如组织样本)中核酸的局部或空间检测(所谓的“空间基因组学”和“空间转录组学”)。特别地，本专利技术涉及用于增加从每个生物样本中捕获和标记的独特核酸的数量和多样性的所述方法的改进。
技术介绍
空间基因组和转录组学方法利用固定在固体基质(例如阵列)上的核酸探针来捕获来自生物样本的核酸(DNA或RNA)随后基于它们在生物样本中的位置标记所述核酸(例如用核酸“条形码”序列)(参见例如WO2012/140224，其通过引用并入本文)。随后将“标记的”核酸从固体基质中释放并分析以产生关于基因的局部化、分布和/或表达的信息，或实际上关于在生物样本(如组织样本)中任何基因组变异(不一定在基因中)的局部化或分布的信息。举例来说，空间转录组学利用包含独特位置标签(结构域，例如条形码序列)的逆转录(RT)引物，其固定在固体基质(例如玻璃片)上，以生成“阵列”。独特的位置标签对应于阵列上RT引物的位置(阵列的特征)。将生物样本(例如组织切片)置于阵列上，并在阵列上的组织切片中进行逆转录反应。组织样品中的RNA结合与RT引物结合(或杂交)，使用该结合的RNA作为模板进行RT引物的延伸，以获得cDNA，该cDNA因此结合到阵列的表面。由于RT引物中独特的位置标签，每条cDNA链携带有关组织切片中模板RNA位置的信息。然后从阵列表面释放cDNA并进行分析(例如测序)，产生具有精确位置信息的转录组。然后可以将序列数据与组织样品中的位置匹配。例如，组织切片可以是可视化的或成像的，例如，在cDNA合成步骤之前或之后染色和拍照，以促进cDNA分子中的位置标签与组织样品内的位置的相关性，并且序列数据可以覆盖在组织样本的图像上，例如，通过使用计算机，以显示跨组织的任何感兴趣基因的表达模式。然而，可视化步骤不是必需的，因为标记的cDNA分子可以使用其他方法与组织样品中的位置相关联，例如，基于已知的组织样本中的细胞或细胞区域的表达特征，具有相同位置标签(即在阵列上的相同位置(特征))捕获的分子的独特轮廓(profile)，可以使分子与组织样品内的位置相关联。空间转录组学和基因组学的灵敏度受到各种因素的限制，包括：(i)核酸分子与捕获探针杂交的效率；(ii)后续延伸反应的效率；(iii)阵列上捕获探针的密度，即阵列的分辨率；(iv)未与捕获探针结合的核酸分子的非特异性延伸，例如，由生物样本中的核酸(例如由生物样本的制备(例如固定组织切片)引起的片段化DNA和RNA)引发的延伸反应。这些限制意味着某些转录本可能在随后的分析中代表性不足。例如，一些转录物在低密度阵列上可能不会被捕获，因为表达它们的组织不与阵列的特征接触。对于低丰度转录物，上述限制可能特别成问题。用于改善阵列上捕获探针密度的方法已在WO2016/162309(通过引用并入本文)中提出，其利用流动池和珠粒阵列技术来生成具有高密度特征的“随机”阵列，即其中捕获探针的位置未预先确定的阵列。
技术实现思路
然而，为了克服本领域已知方法的局限性，存在改善空间转录组学和基因组学方法的灵敏度的空间。在这方面，本专利技术人惊奇地发现，通过将从固体基质(例如阵列)表面释放探针的步骤和使用捕获的核酸作为延伸模板延伸探针的步骤组合，例如释放和扩展步骤同时执行，可以增加由捕获探针捕获的独特核酸分子的数量和多样性。特别地，本专利技术人已经发现可以将用于从固体基质表面释放捕获探针的酶(即裂解酶)与在核酸延伸步骤中使用的反应混合物组合，而基本上不损失裂解酶活性。此外，与预期相反，捕获探针的组合(例如同时)释放和延伸不会消除核酸分子的局部捕获，即生物样本中核酸的空间标记保留在本专利技术的方法中。此外，如下文实施例中详细讨论的，专利技术人有利地确定捕获探针的同时释放和延伸增加了通过本专利技术方法捕获的独特核酸分子的数量和多样性，从而提高了空间转录组学和基因组学方法的灵敏度。虽然不希望受理论束缚，但假设释放和核酸合成步骤的组合可导致一些或所有捕获探针在其延伸之前的局部释放，即探针可被释放到其在阵列上的原始位置附近的局部位置。据认为，这可以通过使捕获探针(未与样品和阵列之间接触的生物样本中的核酸杂交)扩散到样本中来增强方法的灵敏度，从而增加了捕获探针与靶序列杂交的可能性。另外或可替代地，捕获探针同时的释放和延伸可以改善延伸反应，例如DNA合成反应，因为捕获探针不再受物理上的约束，即固定在固体基质上，和/或因为在生物样品和阵列表面之间形成的微反应器环境特别适合模板化核酸延伸反应。因此，一旦捕获探针(当该捕获探针仍固定在固体基质上时，其与靶序列杂交)从阵列表面释放，延伸反应可以更有效地进行。因此，在一个实施方案中，本专利技术提供一种用于空间标记生物样本的核酸的方法，包括：(a)提供固体基质，其上固定有多种捕获探针使得每种捕获探针占据该固体基质上的不同位置，其中所述探针用于引物延伸反应，并且其中每种所述捕获探针包含核酸分子，所述核酸分子包括：(i)用于从固体基质表面释放捕获探针的裂解结构域，(ii)对应于该捕获探针在该固体基质上位置的定位结构域，和(iii)捕获结构域；(b)使所述固体基质与生物样品接触；并且(c)在允许生物样本的核酸与该捕获探针中的捕获结构域杂交的条件下从固体基质表面释放所述捕获探针，并且同时和/或随后使用与捕获探针杂交的核酸分子作为延伸模板延伸所述捕获探针以产生延伸探针，由此空间标记该生物样本的核酸。本专利技术的方法代表了对本领域已知的空间转录组学和基因组学的其他方法的显著改进，例如，WO2012/140224、WO2014/060483和WO2016/162309。本文描述的方法使得从生物样本捕获的独特转录物的数量和多样性增加，从而提供空间标记的更能代表生物样本的表达谱的转录组。此外，在本专利技术方法中，由于捕获探针可以在其延伸之前从阵列表面释放，因此探针不需要通过其5'末端连接至阵列上。在这方面，捕获探针可以通过其3'末端连接至阵列，并且从阵列表面释放捕获探针将暴露探针的3'末端，使得探针能够用作核酸延伸反应的引物。如下面更详细讨论的，本专利技术的方法可以包括分析延伸探针的附加步骤。在这方面，显而易见的是，来自生物样本的核酸的空间标记和随后对所标记核酸的分析的组合促进了生物样本(例如组织样本)中核酸的局部检测。因此，在一个实施方案中，本专利技术的方法可用于确定和/或分析生物样本的所有转录组或基因组，例如，生物样本的全局转录组或基因组。然而，该方法不限于此并且包括确定和/或分析全部或部分转录组或基因组。因此，该方法可以包括确定和/或分析转录组或基因组的一部分或子集，例如，对应于基因子集的转录组，例如一组特定基因，例如与特定疾病或病症、组织类型等有关的基因。从另一个方面来看，上述方法步骤可以被视为提供获得生物样本(例如组织样本)的空间限定的转录组或基因组，特别是空间限定的全局转录组或基因组的方法。从另一方面来看，本专利技术的方法可以被视为用于在生物样本(例如组织样品)中局部或空间检测核酸(无论是DNA还是RNA)的方法，或用于在组织样品中局部或空间检测和/或分析核酸(DNA或RNA)的方法。特别地，该方法可用于组织样品中基因表达或基因组变异的定本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于空间标记生物样本的核酸的方法，包括：(a)提供其上固定有多种捕获探针的固体基质，使得每种捕获探针占据所述固体基质上的不同位置，其中所述探针用于引物延伸反应并且其中每种所述捕获探针包含核酸分子，所述核酸分子包含：(i)用于从所述固体基质表面释放所述捕获探针的裂解结构域，(ii)对应于所述捕获探针在所述固体基质上的位置的定位结构域，和(iii)捕获结构域；(b)使所述固体基质与生物样本接触；(c)在允许所述生物样本的核酸与所述捕获探针中的捕获结构域杂交的条件下从所述固体基质的表面释放所述捕获探针并且同时和/或随后使用与所述捕获探针杂交的核酸分子作为延伸模板延伸所述捕获探针以产生延伸探针，从而空间标记所述生物样本的核酸；其中步骤(c)包括使所述固体基质与含水反应混合物接触，所述含水反应混合物包含：(i)能够使用与所述捕获探针杂交的核酸分子作为延伸模板延伸所述捕获探针的聚合酶；和(ii)用于从所述固体基质表面释放所述捕获探针的工具。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.11.17 GB 1619458.11.一种用于空间标记生物样本的核酸的方法，包括：(a)提供其上固定有多种捕获探针的固体基质，使得每种捕获探针占据所述固体基质上的不同位置，其中所述探针用于引物延伸反应并且其中每种所述捕获探针包含核酸分子，所述核酸分子包含：(i)用于从所述固体基质表面释放所述捕获探针的裂解结构域，(ii)对应于所述捕获探针在所述固体基质上的位置的定位结构域，和(iii)捕获结构域；(b)使所述固体基质与生物样本接触；(c)在允许所述生物样本的核酸与所述捕获探针中的捕获结构域杂交的条件下从所述固体基质的表面释放所述捕获探针并且同时和/或随后使用与所述捕获探针杂交的核酸分子作为延伸模板延伸所述捕获探针以产生延伸探针，从而空间标记所述生物样本的核酸；其中步骤(c)包括使所述固体基质与含水反应混合物接触，所述含水反应混合物包含：(i)能够使用与所述捕获探针杂交的核酸分子作为延伸模板延伸所述捕获探针的聚合酶；和(ii)用于从所述固体基质表面释放所述捕获探针的工具。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述用于从所述固体基质表面释放所述捕获探针的工具包括能够特异地使裂解结构域内的捕获探针裂解的裂解酶。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述裂解结构域包含poly-U序列，并且所述裂解酶包含尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和能够识别dsDNA的脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点的内切核酸酶的混合物，其中所述内切核酸酶优选DNA糖基化酶-裂解酶，例如内切核酸酶VIII。4.根据权利要求2所述的方法，其中所述裂解结构域包含限制性内切核酸酶识别序列，并且所述裂解酶是限制性内切核酸酶。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是逆转录酶。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述逆转录酶选自M-MLV、MuLV、AMV和HIV逆转录酶及其衍生物或突变体，优选其中所述衍生物是序列修饰的衍生物。7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述逆转录酶包含SEQIDNO：2所示的多肽序列或与其具有至少80％序列同一性的多肽序列。8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其中所述逆转录酶由包含SEQIDNO：1所示序列的核苷酸序列或与其具有至少80％序列同一性的核苷酸序列编码。9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述方法还包括合成所述延伸探针的互补链以产生双链延伸探针的步骤。10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述方法还包括扩增所述延伸探针和/或双链延伸探针的步骤。11.根据权利要求10所述的方法，其中扩增所述延伸探针和/或双链延伸探针的步骤包括PCR。12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述方法还包括分析所述延伸探针和/或双链延伸探针和/或其扩增子的步骤。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述分析所述延伸探针和/或双链延伸探针和/或其扩增子的步骤包括分析所述延伸探针和/或双链延伸探针和/或其扩增子的序列。14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述方法还包括将所述分析信息与所述生物样本的图像相关联的步骤，所述分析信息例如为序列分析信息，其中所述生物样本在步骤(c)之前或之后成像。15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，还包括标记步骤(c)中产生的所述延伸探针和/或其互补链和/或扩增子的步骤，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·弗里森，P·斯托尔，J·伦德贝格，F·萨门，S·维奇科维奇，
申请(专利权)人：空间转录公司，
类型：发明
国别省市：瑞典,SE