用于组织样本中核酸的局部或空间检测的方法和产品技术

一种组织样本中的核酸的局部或空间检测的方法和产物,所述方法包括(a)提供包括基板的阵列，所述基板上固定了多种捕获探针，所述探针每种在所述阵列中各占不同位置，且定向为具有3

【技术实现步骤摘要】
用于组织样本中核酸的局部或空间检测的方法和产品


[0001]本专利技术主要涉及组织样本中核酸的局部或空间检测。所述核酸可以是RNA或DNA。因此，本专利技术提供的方法可用于检测和/或分析RNA(例如RNA转录体)或基因组DNA，以获取组织样本(例如个体细胞)中有关基因定位、分布或表达的空间信息，或确切地说，任何基因组变异(不一定非得是基因中的变异)的定位或分布的空间信息。因此，本专利技术使空间基因组学和空间转录组学研究成为可能。
[0002]一种定量和/或定性的方法，能够分析组织样本中的基因组序列分布、位置或表达，其中所述组织样本中保有空间表达、分布或定位格局。因此，所述新方法提供了一种实施“空间转录组学”或“空间基因组学”研究的流程，令使用者能同时测定组织样本中所含的已表达表达基因、基因或基因组位点的表达格局或定位/分布格局。
[0003]具体来说，本专利技术是基于阵列技术与高通量DNA测序技术的联用，捕获并以定位标记来标记组织样本中的核酸分子(例如，RNA或DNA分子)，尤其是mRNA或DNA。然后，合成DNA分子，并对其进行测序和分析，以确定该组织样本的任何部分中哪些基因获得了表达。优选地，可以同时获取该组织样本中每个细胞单独、分开、特定的转录组。因此，本专利技术的方法可说是提供了组织样本中个体细胞高度并行的综合转录组签名，且不会丢失所述受测组织样本中的空间信息。本专利技术还提供了一种实施本专利技术方法的阵列及制作本专利技术阵列的方法。

技术介绍

[0004]人体含有超过100万亿个细胞，这些细胞组成了超过250个不同的器官和组织。我们还远未理解大脑等复杂器官的发育和组织，因此，还有必要利用量化的方法剖析这些组织中所表达基因的表达形式，确定控制这些组织发育和功能的基因。这些器官自身便是分化细胞的混合体，所述细胞使得如营养运输、防御等各种身体机能得到协同和维持。因此，细胞功能取决于该细胞在特定组织结构中的位置和它与该组织中其它细胞间直接和间接的相互作用。因此，有必要理清这些相互作用如何在转录水平上影响组织中的每个细胞。
[0005]RNA深度测序的最新发现表明，人体细胞系中的大多数转录体都能被检测，且大部分(75％)的人类蛋白质编码基因都在大多数组织中有所表达。类似地，一项针对1％的人类基因组的详细研究表明，染色体进行的是泛转录，全部碱基中有大部分被包含在初级转录体中。因此，可以说该转录机制在全局水平上是混杂的。
[0006]众所周知，转录体仅是蛋白质丰度的近似指标，因为从任何一个转录体生成的蛋白质数量都受到RNA翻译、降解速度等的影响。对此，最近有一项人体器官和组织的免疫分析暗示，组织特异性是通过对蛋白质水平的精确时间、空间控制来获得的，且身体不同组织获取其独有特质的途径，并非通过控制蛋白质表达的种类，而是通过控制每种蛋白质的表达数量。
[0007]然而，接下来有全局研究比较了转录组和蛋白质组的相关性，证明全体基因中的大部分都得到了表达。有趣的是，研究发现个体基因产物的RNA变化和蛋白质水平间存在高相关性，这就表明，对个体细胞转录组的研究对了解蛋白质的功能角色上具有生物学意义。
[0008]的确，对生物组织的细胞组织和表达格局的分析，是生物医学研究和诊断学上的里程碑。细胞组织学运用各种染色技术，在一个多世纪前便首先确定了健康器官的基本结构机制和常见病理学变化。该领域的发展，带来了以免疫组织化学和原位杂交的基因表达来研究蛋白质分布的可能性。
[0009]但是，愈发先进的组织学和基因表达技术并行发展，却导致了成像技术与转录组分析的分离，因而在本专利技术提供的方法之前，还没有任何将空间分辨率用于全转录组分析的可行办法。
[0010]作为原位技术的替代方式或补充方式，蛋白质和核酸的体外分析方法也得到了发展，即：从完整组织样本、单一细胞类型或甚至单个细胞中提取分子，并在所述提取物中通过ELISA、qPRC等方法对特定分子进行定量。
[0011]基因表达分析的最新发展，为利用微阵列或RNA测序评估组织的完整转录组提供了可能，这些发展有助于我们对生物过程的理解和诊断学研究。然而，典型的转录组分析以从整块组织(或者甚至完整生物体)提取的mRNA为实施对象，但是要收集较小的组织区域或个体细胞用于转录组分析，却一般非常费力、费钱且精确度低。
[0012]因此，大多数基于微阵列或下一代RNA测序的基因表达研究，都采用包含许多细胞的代表性样本，由此一来，研究结果代表的是受测基因的平均表达水平。在某些情况下，除全局基因表达平台外，还对具有显著差异的细胞进行了分离(Tang F et al,Nat Protoc.2010；5:516
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35；Wang D&Bodovitz S,Trends Biotechnol.2010；28:281
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90)，获得了关于细胞间差异的非常精确的信息。然而，至今为止，还没有以高分辨率来研究完整组织中的转录活性的高通量方法。

技术实现思路

[0013]因此，基因表达格局分析的现有技术一次仅能提供一个或几个基因的转录信息，或在提供同一样本中的所有基因信息的同时损失其位置信息。因此，显然需要能够同时、分别、特异测定样本中每个细胞的转录组的方法，即是说，需要能够提供含空间分辨率的转录信息的组织样本全局基因表达分析方法，而本专利技术就满足了这一需要。
[0014]本专利技术中所述方法和产物的创新途径，采用了目前业已完善的阵列和测序技术来获得一个样本中全部基因的转录信息，且同时保留每个转录体的位置信息。对本领域技术人员来说，这显然是生命科学中的一个里程碑。该新技术开创了所谓“空间转录组学”的新领域，并可能将对我们对所有多细胞生物的组织发育和组织、细胞功能方面的认识带来深远的影响。显然，这样的技术在促进对疾病状态的成因和发展的理解和开发针对这些疾病的有效治疗措施方面将尤其有用，例如癌症。本专利技术的方法还可应用在许多疾病的诊断中。
[0015]虽然如下具体所述，本专利技术最初的目的在于转录组研究，本专利技术的原理和方法还可以应用于DNA分析，由此也能用于基因组分析(“空间基因组学”)。由此一来，在最广泛意义上，本专利技术主要可用于核酸的检测和/或分析。
[0016]阵列技术，特别是微阵列，发源于斯坦福大学的研究，该研究将少量DNA寡核苷酸成功地贴附在玻璃表面，呈有序排列，即所谓的“阵列”，并用其监控了45个基因的转录(Schena M et al,Science.1995；270:368
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9,371)。
[0017]自此以后，全世界的科学家们运用微阵列技术已经发表了超过3万篇论文。多种微
阵列被开发出来，以适应各种应用，例如，检测单核苷酸多态性(SNPs)或基因型或重新测序突变基因组，且微阵列技术的一项重要应用是基因表达分析。的确，基因表达微阵列的专利技术目的是用作一种分析特定样本中已表达基因材料水平的方法，但其真正的成功却在于为同时比较许多基因的表达水平带来了可能。针对此类实验，市场上有若干现成的微阵列平台商本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于在组织切片中局部检测RNA的方法，该方法包括：(a)在基板上提供包括多个特征的阵列，其中每个特征占据所述阵列上的不同位置，其中所述多个特征中的特征包括固定在其上的多个捕获探针，并且其中所述多个捕获探针包含具有以下从5'至3'取向的结构域的核酸分子：(i)包含定位域的第一序列，该定位域包含所述特征所特有的核苷酸序列；和(ii)包含捕获域的第二序列，该捕获域包含与待检测的RNA互补的核苷酸序列；(b)使所述阵列与组织切片接触并允许所述组织切片的至少一种RNA与捕获探针的捕获域杂交；(c)通过使用杂交的RNA作为延长模板延长捕获探针，产生cDNA分子，使得产生的cDNA分子包含所述定位域的核苷酸序列；(d)从所述阵列释放所产生的cDNA分子或其部分，或与所产生的cDNA分子或其部分互补的第二链，和(e)鉴定释放的cDNA分子中所述定位域的核苷酸序列，或其互补链；和(f)将所述定位域的核苷酸序列与所述阵列上的不同位置相关联，从而检测所述组织切片中的RNA。2.根据权利要求1的方法，其特征在于，进一步在步骤(c)和(d)之间包括：产生与所产生的cDNA分子或其部分互补的第二链的步骤。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(d)包括：通过变性，从所述捕获探针的捕获域中释放所产生的cDNA分子或其部分，或与所产生的cDNA分子或其部分互补的第二链。4.根据权利要求1的方法，其特征在于，进一步包括扩增从阵列释放的所产生的cDNA或其部分、与所产生的cDNA或其部分互补的第二链的步骤。5.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述捕获探针进一步包含位于所述定位域的5'侧的剪切域。6.根据权利要求5的方法，其特征在于，进一步包括剪切所述捕获探针的剪切域，其中剪切包括应用剪切酶，该剪切酶识别剪切域中的核苷酸序列，并在定位域5
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侧的一个位置处剪切所产生的cDNA分子，从而从所述阵列上的特征释放所产生的cDNA分子或其部分，或所述第二链或其部分。7.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述RNA选自mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、核酶RNA、反义RNA和非编码RNA。8.根据权利要求7的方法，其特征在于，所述RNA是mRNA。9.根据权利要求8的方法，其特征在于，所述捕获探针的捕获域与mRNA的poly
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A尾杂交。10.根据权利要求9的方法，其特征在于，所述捕获域包含poly
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T序列。11.根据权利要求1的方法，其特征在于，该方法进一步包括在步骤(c)之前对组织切片进行染色的步骤。12.根据权利要求1的方法，进一步包括将步骤(f)中获得的核苷酸序列与组织切片的成像相关联，其中该方法包括在步骤(c)之前对组织切片进行成像的步骤。
13.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述多个捕获探针中的捕获探针具有自由的3'端。14.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述捕获探针通过接头固定在所述基板上。15.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述阵列是珠阵列并且所述捕获探针固定在所述珠阵列的珠上。16.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述阵列包括至少1,000个特征。17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阵列的特征具有约小于100微米、约小于50微米、约小于约20微米或约小于10微米的平均直径。18.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述基板包括一个或多个阵列。19.根据权利要求18的方法，其特征在于，所述一个或多个阵列包含相同的定位域。20.根据权利要求18的方法，其特征在于，所述一个或多个阵列包含不同定位域。21.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述捕获探针进一步包含引物结合位点。22.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述组织切片包括固定的或新鲜冷冻的组织切片。23.根据权利要求22的方法，其特征在于，固定的组织切片是福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片。24.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述多个特征包括印刷或光刻沉积特征。25.根据权利要求1的方法，其特征在于，鉴定所述定位域的核苷酸序列包括测序。26.组合物，包括：多个mRNA分子，其与基板上包含多个特征的阵列的多个捕获探针的捕获域杂交，其中所述多个捕获探针中的捕获探针包括：核酸序列，其附着在基板上的多个特征中的特征上；和定位域，其包含对所述多个特征中的特征而言独有的核酸序列。27.根据权利要求26的组合物，其特征在于，所述捕获探针通过其5'端附着在所述特征上。28.根据权利要求26或27的组合物，其特征在于，所述基板适合用作测序平台。29.根据权利要求28的组合物，其特征在于，所述测序平台是下一代测序平台。30.根据权利要求26
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29中任一项的组合物，其特征在于，所述阵列是珠阵列。31.根据权利要求26
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30中任一项所述的组合物，其特征在于，所述捕获域包含poly(T)序列。32.根据权利要求31所述的组合物，其特征在于，所述poly(T)序列包含至少10个脱氧胸苷残基。33.根据权利要求26
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32中任一项的组合物，其特征在于，所述捕获探针包含剪切域。34.根据权利要求33的组合物，其特征在于，所述剪切域包含至少五个dUTP碱基或一个或多个错配核苷酸。35.根据权利要求26
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34中任一项所述的组合物，其中所述捕获探针进一步包含扩增域。36.根据权利要求35所述的组合物，其特征在于，所述捕获探针在5'至3'方向包含以下结构域：
i)剪切域；ii)扩增域；iii)定位域；和iv)捕获域。37.根据权利要求26
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36中任一项的组合物，其特征在于，使用所述杂交的mRNA分子作为模板延长了所述捕获探针的3'端，以产生与所述杂交的mRNA互补的序列。38.根据权利要求26
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37中任一项所述的组合物，其特征在于，所述捕获探针包含DNA、RNA、PNA或其组合。39.根据权利要求26
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38中任一项所述的组合物，其特征在于，所述捕获探针具有自由的3'端。40.根据权利要求26
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39中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含反转录酶。41.用于检测组织切片中的核酸的位置的方法，包括：(a)提供包括多个捕获探针的基板，其中所述多个捕获探针中的捕获探针包括：(i)与核酸结合的捕获域，和(ii)包含核苷酸序列的定位域，其中每个所述定位域的所述核苷酸序列唯一对应所述基板上的不同位置；(b)令所述组织切片与所述基板接触；(c)从所述基板释放所述捕获探针；(d)使用与所述捕获域相结合的所述组织切片的所述核酸作为模板，延长所述捕获探针的3
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端，以产生延长的核酸产物；和(e)确定(i)与所述捕获域结合的组织切片的核酸或其互补链的全部或部分核苷酸序列，和(ii)所述定位域的核苷酸序列或其互补链，其中(i)和(ii)的核苷酸序列指示所述核酸是通过所述捕获探针从基板上不同位置处的组织切片获得，从而确定所述组织切片中所述核酸的位置。42.根据根据权利要求41所述的方法，其特征在于，所述基板包含聚合物。43.根据权利要求41的方法，其特征在于，所述核酸是DNA。44.根据权利要求41的方法，其特征在于，所述核酸是RNA。45.根据权利要求41的方法，其特征在于，所述捕获域包含用于捕获mRNA的核苷酸序列，其中在所述捕获域中包含poly
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T序列。46.根据权利要求42的方法，其特征在于，将所述聚合物附着到固体支持物上。47.根据权利要求42的方法，其特征在于，所述固体支持物包括玻璃、硅、聚赖氨酸涂层材料、硝化纤维素、聚苯乙烯、环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、聚丙烯、聚乙烯、和聚碳酸酯中的一种。48.根据权利要求41的方法，其特征在于，所述步骤(d)中的延长包括进行反转录反应，并且其中产生的延长核酸产物是cDNA。49.根据权利要求41的方法，其特征在于，所述步骤(e)中的确定包括扩增全部或部分所述延长的核酸产物或其互补链，以产生一种或多种扩增的核酸产物。50.根据权利要求49的方法，其特征在于，所述方法进一步包括从所述基板释放所述一
种或多种扩增的核酸产物。51.根据权利要求41的方法，其特征在于，所述步骤(e)中的确定包括测序。52.根据权利要求41的方法，其特征在于，所述方法还包括对组织切片进行成像，并且所述方法还包括将所述定位域的核苷酸序列与被成像的组织切片中的位置相关联。53.根据权利要求27的方法，其特征在于，所述成像包括以下一项或多项：光、明视场、暗视场、相位差、荧光显微术、镜像、干涉和共聚显微镜。54.根据权利要求41的方法，其特征在于，所述捕获探针包含以下5'至3'取向的结构域：(i)剪切域，(ii)定位域，以及(iii)捕获域；其中从基板释放捕获探针的步骤包括剪切所述剪切域。55.根据权利要求41的方法，其特征在于，步骤(c)中的释放包括酶促裂解、化学裂解或加热。56.用于检测组织切片中的核酸的位置的方法，包括：(a)提供包括多个捕获探针的基板，其中所述多个捕获探针中的捕获探针包括：(i)与核酸结合的捕获域，和(ii)包含核苷酸序列的定位域，其中每个所述定位域的所述核苷酸序列唯一对应所述基板上的不同位置；(b)令所述组织切片与所述基板接触；(c)对一个或多个荧光标记探针进行成像；(d)从所述基板释放所述捕获探针；(e)使用与所述捕获域相结合的所述组织切片的所述核酸作为模板，延长所述捕获探针的3
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端，以产生延长的核酸产物；和(f)确定(i)与所述捕获域结合的组织切片的核酸或其互补链的全部或部分核苷酸序列，和(ii)所述定位域的核苷酸序列或其互补链，其中(i)和(ii)的核苷酸序列指示所述核酸是通过所述捕获探针从基板上不同位置处的组织切片获得，从而确定所述组织切片中所述核酸的位置。57.根据权利要求56的方法，其特征在于，所述基板包含聚合物，并且所述聚合物附着到固体支持物上。58.根据权利要求57的方法，其特征在于，所述固体支持物包括玻璃、硅、聚赖氨酸涂层材料、硝化纤维素、聚苯乙烯、环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、聚丙烯、聚乙烯、和聚碳酸酯中的一种。59.根据权利要求56的方法，其特征在于，所述核酸是DNA。60.根据权利要求56的方法，其特征在于，所述核酸是RNA。61.根据权利要求56的方法，其特征在于，所述捕获域包含用于捕获mRNA的核苷酸序列。62.根据权利要求36的方法，其特征在于，所述捕获域包含poly
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T序列。63.根据权利要求56的方法，其特征在于，步骤(e)中的延长包括进行反转录反应，并且
其中产生的延长核酸产物是cDNA。64.根据权利要求56的方法，其特征在于，(e)中的确定包括扩增全部或部分延长的核酸产物或其互补链，以产生一种或多种扩增的核酸产物。65.根据权利要求56的方法，其特征在于，所述方法进一步包括从所述基板释放所述一种或多种扩增的核酸产物。66.根据权利要求56的方法，其特征在于，进一步包括将所述定位域的核苷酸序列与被成像的组织切片中的位置相关联。67.根据权利要求56的方法，其特征在于，所述捕获探针包含以下5'至3'取向的结构域：(i)剪切域，(ii)定位域，以及(iii)捕获域；其中从基板释放捕获探针的步骤包括剪切所述剪切域。68.根据权利要求56的方法，其特征在于，步骤(c)中的释放包括酶裂解、化学裂解或加热。69.根据权利要求56的方法，其特征在于，步骤(e)中的确定包括测序。70.根据权利要求56的方法，其特征在于，所述成像包括以下一项或多项：光、明视场、暗视场、相位差、荧光显微术、镜像、干涉和共聚显微镜。71.用于在包含细胞的组织样本中局部检测DNA的方法，所述方法包括：(a)提供在基板上包含多个特征的阵列，每个特征包含固定在其上的不同捕获探针，使得捕获探针具有自由的3'端，每个特征占据所述阵列上的不同位置并面积为小于约1mm2，每个捕获探针由核酸分子组成，该核酸分子包含以下5'至3'方向的结构域：(i)包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔纳斯，
申请(专利权)人：空间转录公司，
类型：发明
国别省市：