本发明专利技术公开了一种检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒，包括酶标记的纤维连接蛋白的抗体或者酶标记的纤维连接蛋白的单克隆抗体或者酶标记的纤维连接蛋白的多克隆抗体；包被有纤维连接蛋白的抗体或者纤维连接蛋白的单克隆抗体或者纤维连接蛋白的多克隆抗体的载体；纤维连接蛋白校准品；化学发光底物和洗涤液。还提供了上述试剂盒的制备方法。本发明专利技术的试剂盒具有高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速等优点，并且使用成本低，更易推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫分析及生物医学领域，尤其涉及一种检测试剂盒及其制备方法，特别是一种采用化学发光免疫分析法检测尿液中纤维连接蛋白又称纤维结合蛋白(FN)浓度的试剂盒及其制备方法。
技术介绍
纤维连接蛋白又称纤维结合蛋白(Fibronectin,简称FN),有两条相类似的多肽链亚基组成，亚基的分子量为220-250KD。现有技术中采用免疫扩散法和ELISA双抗体夹心技术测定尿液中纤维连接蛋白(FN)浓度，其缺点为操作繁琐、工作强度大、保持时间长，一般需8-48小时、其定量的精确度差。因尿液中纤维连接蛋白(FN)的浓度低，所以国内外至今未见有用试剂盒及方法的报导。本专利技术申请的测定尿液中纤维连接蛋白(FN)浓度的试剂盒及方法可用于泌尿系统的肿瘤早期筛查。化学发光免疫分析(ChemiluminescenceImmunoassay, CLIA)于 1977 年问世，1985年第一代化学发光免疫分析试剂盒研制成功并投放市场。进入九十年代，化学发光免疫分析试剂盒的研制和自动化测量仪的生产取得了突破性进展，从而进入高速发展阶段。化学发光免疫分析是继荧光、放射性同位素和酶免疫分析之后发展起来的一项新的免疫分析技术，根据大量的实验结果及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看，在非放射性标记分析技术中化学发光免疫分析处于领先地位，它不仅具有免疫反应的特异性，而且具有高灵敏性和稳定性。化学发光免疫分析技术具有灵敏度高、快速、准确、重复性好、效期长并安全无毒无污染等优点，成为取代放射免疫分析和酶免疫分析技术的首选。
技术实现思路
针对现有技术中存在的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种，本专利技术将化学发光技术与纤维连接蛋白(FN)的免疫分析学有效地结合，提供了一种高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速地检测尿液中纤维连接蛋白(FN)的浓度的试剂盒，该试剂盒适于在产业上能有效地推广应用。本专利技术一种检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒，包括:酶标记的纤维连接蛋白(FN)的抗体或者酶标记的纤维连接蛋白(FN)的单克隆抗体或者酶标记的纤维连接蛋白(FN)的多克隆抗体；包被有纤维连接蛋白(FN)的抗体或者纤维连接蛋白(FN)的单克隆抗体或者纤维连接蛋白(FN)的多克隆抗体的载体；纤维连接蛋白(FN)校准品；化学发光底物和洗涤液。进一步的，所述载体为聚苯乙烯微孔板、聚苯乙烯珠或管或磁性颗粒。进一步的，所述的洗涤液为1，2-二氧乙烷类衍生物，所述的1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烧)_1，2_ 二氧乙烧、或者3- (2’ -螺旋金刚烧)~4_甲氧基-4- (3’ -憐酸氧基)苯基-1，2- 二氧乙烷、精制的二磷酸胞苷(⑶P-Star )。进一步的，所述化学发光底物为包含有缓冲液，每升缓冲液中含有24gTris、160gNaCl、4g KCl、15mL HCl、Iml Proclin300 和 200ml 的 3- (2，-螺旋金刚烷)-4-曱氧基_4_ (3’ -憐酸氧基)苯基_1，2- 二氧乙烧，余量为双蒸水。本专利技术还提供了上述试剂盒的制备方法，包括一个制备包被有纤维连接蛋白(FN)的抗体或者纤维连接蛋白(FN)的单克隆抗体或者纤维连接蛋白(FN)的多克隆抗体的载体的步骤，一个用碱性磷酸酶标记纤维连接蛋白(FN)的抗体或者纤维连接蛋白(FN)的单克隆抗体或者纤维连接蛋白(FN)的多克隆抗体的步骤；还包括一个以纤维连接蛋白(FN)纯品配制纤维连接蛋白(FN)校准品的步骤，一个配制洗涤液的步骤，一个配制化学发光底物的步骤，以及分装上述各组份并组装为成品的步骤。进一步的，在一个制备包被有纤维连接蛋白(FN)的抗体或者纤维连接蛋白(FN)的单克隆抗体或者纤维连接蛋白(FN)的多克隆抗体的载体的步骤中，首先将纤维连接蛋白(FN)的抗体或者纤维连接蛋白(FN)的单克隆抗体或者纤维连接蛋白(FN)的多克隆抗体用0.05MpH为7.2的磷酸盐緩冲液配制成所需浓度(如10ug/ml)的包被液；然后进行包被，在包被的过程中采用生理盐水洗涤2-5次；最后使用pH值为7.0?7.5的磷酸盐封闭液进行封闭。进一步的，在一个用碱性磷酸酶标记纤维连接蛋白(FN)的抗体或者纤维连接蛋白(FN)的单克隆抗体或者纤维连接蛋白(FN)的多克隆抗体的步骤中，所述的碱性磷酸酶标记是采用戊二醛法进行标记。进一步的，所述的酶可以为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。其中，所述纤维连接蛋白(FN)校准品为标准级，纯度不低于90%、抗体包被板为48或96孔的微孔板条、酶标记纤维连接蛋白(FN)为偶联碱性磷酸酶、化学发光底物液为AMPPD、浓缩洗涤液为Tris-HCl。本专利技术的试剂盒可以准确地定量检测出人尿液中纤维连接蛋白(FN)的含量。它具有高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速等优点。该尿纤维连接蛋白(FN)测定试剂盒(化学发光法)的各项指标均达到或超过透射(散射)比浊免疫分析法。并且，根据本专利技术的检测系统为开放式操作，简便快速，不需要昂贵的全自动化学发光测量仪，特别适合广大的中小医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。根据本专利技术的试剂盒，酶标记的纤维连接蛋白(FN)抗体与载体上包被的纤维连接蛋白(FN)抗体和被测样品的纤维连接蛋白(FN)抗原形成“双抗体夹心”结构，因此本专利技术采用的“双抗体夹心一步法”反应模式，既有效地利用了化学发光技术原理、又确保了检测的灵敏性。本专利技术的试剂盒应用的是酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光信号代替酶联免疫分析中的显色底物，因而具有与透射(散射)比浊免疫分析法同等的特异性，而灵敏度大大提高，比现今的透射(散射)比浊免疫分析法分析灵敏度提高约10倍，可为临床诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。在本专利技术的研究过程中，本专利技术的专利技术人首先对所用的原材料进行了筛选实验和质量鉴定，包括标记抗体与包被抗体的活性、载体(如不透光的白色微孔板)的吸附性能和变异大小、ALP的活性、化学发光底物的发光强度及发光持续时间等。然后对包被方法进行了研究，用不同的包被緩冲液和保护液进行实验，选择出最适合的包被緩沖液和保护液，通过抗体不同包被浓度实验找到最佳的浓度条件。对于ALP的标记可以有不同的方法，通过反复探索和对比实验最终找到了简便、产率高、成本低、质量可靠的标记方法，并对不同的酶稀释液进行了长期的考察实验，配制出了能够使酶标记物长期保持活性稳定的稀释液。本专利技术与已有技术相比，其技术进步是显著的。本专利技术将化学发光技术与纤维连接蛋白(FN)的免疫分析学有效地结合，提供了一种高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速地检测尿液中纤维连接蛋白(FN)的浓度的化学发光免疫分析定量测定试剂盒，本专利技术的试剂盒可应用于开放式的化学发光测量仪，使用成本低，更易推广应用。【附图说明】图1检测100例正常人尿液样本中纤维连接蛋白(FN)浓度(mg/L)。图2是本试剂盒的线性范围实验结果。【具体实施方式】实施例1本专利技术的试剂盒的制备方法一、酶标抗体制备纤维连接蛋白(FN)抗体用戊二醛法与碱性磷酸酶偶联，对PBS充分透析，加等体积甘油，-2 (TC以下保存。酶标单抗稀释液配制称量12.12g的Tris，5g BSA和Im本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒，其特征在于包括：酶标记的纤维连接蛋白的抗体或者酶标记的纤维连接蛋白的单克隆抗体或者酶标记的纤维连接蛋白的多克隆抗体；包被有纤维连接蛋白的抗体或者纤维连接蛋白的单克隆抗体或者纤维连接蛋白的多克隆抗体的载体；纤维连接蛋白校准品；化学发光底物和洗涤液。
【技术特征摘要】
1.一种检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒，其特征在于包括:酶标记的纤维连接蛋白的抗体或者酶标记的纤维连接蛋白的单克隆抗体或者酶标记的纤维连接蛋白的多克隆抗体；包被有纤维连接蛋白的抗体或者纤维连接蛋白的单克隆抗体或者纤维连接蛋白的多克隆抗体的载体；纤维连接蛋白校准品；化学发光底物和洗涤液。2.如权利要求1所述的一种检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒，其特征在于:所述载体为聚苯乙烯微孔板、聚苯乙烯珠或管或磁性颗粒。3.如权利要求1所述的一种检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒，其特征在于:所述的洗涤液为1，2_ 二氧乙烷类衍生物，所述的1,2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2_二氧乙烧、或者3- (2’ -螺旋金刚烧)~4_甲氧基-4- (3’ -憐酸氧基)苯基-1，2- 二氧乙烧、或者 CSPD、或者 CDP-Star。4.如权利要求1所述的一种检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒，其特征在于:所述化学发光底物为缓冲液，每升缓冲液中含有24gTris、160gNaCl、4g KCl、15mL HCl、ImlProclin 300和200ml的3- (2’ -螺旋金刚烷)~4~曱氧基-4- (3’ -磷酰氧基)苯基_1，2-二氧乙烷，余量为双蒸水。5.权利要求1所述的试剂...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱晓敏，刘颖成，刘颖冰，杨杰，
申请(专利权)人：上海北加生化试剂有限公司，
类型：发明
国别省市：
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