一种增强T细胞抗肿瘤活性的核酸分子制造技术

本发明专利技术涉及一种含DAP10蛋白胞内段的新的嵌合抗原受体(CAR)分子，以及编码其的核酸，表达其的细胞，以及其在制备治疗肿瘤的药物中的用途。本发明专利技术的CAR分子是在传统的第二代CAR分子中引入DAP10蛋白的胞内段而实现的，其通过CAR分子与靶抗原结合后激活T细胞DAP10下游信号通路，以提升相应的CART细胞对实体肿瘤在体内、体外的杀伤作用，增强其增殖存活能力。

【技术实现步骤摘要】
一种增强T细胞抗肿瘤活性的核酸分子
本专利技术涉及肿瘤的细胞免疫治疗
，具体地，涉及一种含DAP10蛋白胞内段的嵌合抗原受体，编码其的核酸和表达其的细胞，以及其在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
技术介绍
嵌合抗原受体(CAR,ChimericAntigenReceptors)T细胞是表面表达识别特定抗原并能传递信号的嵌合型受体的T细胞。CART细胞通过表达嵌合抗原受体(CAR)分子而在抗肿瘤中发挥重要作用，CAR分子通常包括胞外段、跨膜区和胞内段：胞外段是由抗体重链和轻链可变区通过一条肽段相连接而形成的单链可变区(ScFv)；胞内段是各种信号传导分子的胞内段嵌合体，包括CD3zeta、CD28、OX-40、4-1BB等；跨膜区则来自其他分子(如CD8，CD4，CD28和CD3zeta)的跨膜区。单链可变片段部分的基因分离自例如产生识别靶抗原的单克隆抗体的杂交瘤。表达CAR分子的T细胞独立于肿瘤细胞上的主要组织相容性抗原I型的表达而直接识别肿瘤细胞表面抗原，并且在同时激活T细胞，并因此表达CAR的T细胞可以有效杀伤肿瘤细胞。简言之，CART细胞通过抗原-抗体识别模式对肿瘤细胞表面的特异分子进行识别，然后通过其胞内的信号传导进行激活、增殖并发挥细胞杀伤功能。CAR分子的结构设计经历多代的研究发展。第一代CAR分子的结构包含识别肿瘤细胞表面抗原的单链可变片段(scFv)、跨膜结构域和激活T细胞的TCR复合物CD3ζ的胞内结构域。由于第一代CAR的胞内段只有CD3ζ信号传递区域，没有共刺激信号，因而第一代CART细胞的功能存在很大缺陷，其在病人体内的扩增、持久性和效应功能等方面都表现出低水平。为了增强第一代CAR激活T细胞的能力的目的，已经开发出第二代CAR，第二代CAR在胞内加入了共刺激分子(如CD28、CD134(OX-40)、CD137(4-1BB)等)来源的胞内分子信号传递域。临床试验表明，第二代CART细胞在病人体内表现出较好的增殖、持久性和效应功能。第二代CART细胞的临床试验，大部分是抗CD19CART对B细胞白血病的治疗。虽然CART细胞临床试验获得了疗效，但还存在进一步改善的空间。第三代CAR是为了进一步提高CART细胞疗法的疗效而开发的。第三代CAR的胞内段引入了两个共刺激分子的信号传递区域。通常情况下，一个共刺激信号是CD28胞内区域，另一个则是CD134、CD137或ICOS等的胞内信号传递区域。共刺激信号的不同组合可能影响CART细胞的功能和疗效，研究表明，并不是所有的第三代CAR都比第二代好。DAP10是一个在造血细胞上表达的独立跨膜衔接蛋白，通过与激活性受体NKG2D作用形成复合物，可在肿瘤发生、感染、自身免疫应答反应中识别异常高表达的相关配体。DAP10信号在维持自身免疫耐受中具有重要的生理学作用。根据已报道的文献，人的NKG2D受体是DAP10唯一的结合作用受体，通过胞外段半胱氨酸的二硫键结合形成二聚体。DAP10胞内区域包含Tyr-Ile-Asn-Met基序，与PI3K的调节亚基p85的Src同源段2区域结合。DAP10与p85结合后，与信号分子Grb2与Vav1的相互作用，起始下游Rho家族鸟苷酸三磷酸酶和C-γ2磷酸酶的激活和累积，以起始免疫细胞的激活。与一个NKG2D配体的结合可启动4个DAP10分子的磷酸化，在低配体浓度的情况下，扩大信号传递。NKG2D-DAP10受体复合物表达于NK、γδT、NKT和胸腺细胞，且会随着固有免疫刺激的上调表达。在人体内，NKG2D只与DAP10相互作用产生免疫效应，而在小鼠细胞表达两个NKG2D异构体：NKG2D-1和NKG2D-2，NKG2D-1只与DAP10作用，而NKG2D-2则可与DAP10、DAP12作用。鼠源NKG2D-DAP10受体的配体是I类主要组织相容性复合物(MHCI)。研究发现，通过在C57BL/6小鼠中敲除NKG2D，提高了小鼠在甲基胆蒽诱导纤维肉瘤中的敏感性，这验证了NKG2D-DAP10在监控肿瘤发生中具有重要作用(NKG2Dfunctionprotectsthehostfromtumorinitiation.JExpMed2005；202:583–588.)。NKG2D在自体免疫反应中也发挥着作用。阻断NKG2D的功能将抑制NOD小鼠体内自体反应CD8+T细胞的增殖，并提高自发糖尿病NOD小鼠的存活率。名为“AChimericReceptorwithNKG2DSpecificityEnhancesNaturalKillerCellActivationandKillingofTumorCells”的一篇科技文献中阐述了一种应用于NK细胞上的新型嵌合抗原受体——CARNKG2D-DAP10-CD3ε，其主要通过提高肿瘤抗原的特异性识别和激活能力以增强NK细胞的体内外抗肿瘤功能；而NKG2D可特异性识别肿瘤特异性抗原MIC和RAET1/ULBP，并通过DAP10激活下游信号通路；DAP10在该嵌合抗原受体中的主要作用为帮助NKG2D受体定位于细胞膜上。目前，CART细胞已在血液肿瘤的临床前和临床试验中取得了很好的疗效，但对于实体肿瘤其疗效并不确切。根据肿瘤免疫学和肿瘤微环境的基本原理，CART细胞在体内可能难以克服实体肿瘤微环境的抑制作用，其效应功能(如细胞杀伤，细胞因子分泌等)被直接抑制或因为耗竭作用难以进行；此外，CART细胞的增殖存活能力亦被肿瘤微环境所削弱，使CART细胞在肿瘤中的数量难以为继。因此，需要找到途径和方法以切实提升CART细胞对实体肿瘤在体内、体外的杀伤作用，增强其增殖存活能力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种含DAP10蛋白胞内段的新的嵌合抗原受体(CAR)分子，以及编码其的核酸，表达其的细胞，以及其在制备治疗肿瘤的药物中的用途。本专利技术在传统的第二代CAR分子中引入DAP10蛋白的胞内段，其通过CAR与靶抗原结合后激活T细胞DAP10下游信号通路，以期达到提升相应的CART细胞对实体肿瘤在体内、体外的杀伤作用，增强其增殖存活能力的目的。本专利技术通过以下技术方案实现上述目的：第一方面，本专利技术提供了一种嵌合抗原受体，其包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中，所述胞内结构域包括DAP10蛋白的胞内段序列。上述嵌合抗原受体中，所述DAP10蛋白的胞内段序列为:LCARPRRSPAQDGKVYINMPGRG(如SEQIDNO:12所示)，其相应的核苷酸序列为：5’-ctgtgcgcacgcccacgccgcagccccgcccaagaagatggcaaagtctacatcaacatgccaggcaggggc-3’(如SEQIDNO:13所示)。作为优选，所述胞内结构域包括1～9个、优选1～3个DAP10蛋白的胞内段序列；优选地，所述胞内结构域包括通过串联方式连接在一起的两个或更多个DAP10蛋白的胞内段序列。在具体实施方案中，上述CAR分子可以仅以一个或多个DAP10蛋白的胞内段序列作为其胞内结构域，还可以包含除了DAP10蛋白胞内段序列之外的一个或多个(例如2个或3个)其它胞内结构域。例如，所述胞内结构域还可包括胞内共刺激信号传导域和/或CD3ζ信号传导域；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嵌合抗原受体，其包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中，所述胞内结构域包括DAP10蛋白的胞内段序列。

【技术特征摘要】
2017.01.24 CN 20171005475911.一种嵌合抗原受体，其包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中，所述胞内结构域包括DAP10蛋白的胞内段序列。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述DAP10蛋白的胞内段序列如SEQIDNO:12所示；优选地，所述胞内结构域包括1～9个、优选1～3个DAP10蛋白的胞内段序列；优选地，所述胞内结构域包括通过串联方式连接在一起的两个或更多个DAP10蛋白的胞内段序列；优选地，所述胞内结构域还包括胞内共刺激信号传导域和/或CD3ζ信号传导域；优选地，所述胞内共刺激信号传导域选自如下的蛋白质的功能信号传导结构域：CD28、4-1BB、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、CD27、CD28、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM、SLAMF7、NKp80、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1、SLAMF4、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、Ly9、CD160、PSGL1、CD100、CD69、SLAMF6、SLAM、BLAME、SELPLG、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D或CD83中的任意一种或至少两种的组合，优选为TLR2、4-1BB或CD28中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述能够结合抗原的胞外结构域是指所述抗原的受体胞外段，或者所述抗原的特异性抗体的单链可变片段；优选地，所述抗原是肿瘤抗原和/或肿瘤相关辅助细胞抗原；优选地，所述肿瘤抗原和/或肿瘤相关辅助细胞抗原选自5T4、α5β1-整联蛋白、707-AP、AFP、ART-4、BAGE、β-联蛋白/m、Bcr-abl、MN/CIX抗体、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CD4、CD19、CD20、CD22、CD25、CDC27/m、CD30、CD33、CD52、CD56、CD80、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、EGFR、ErbB3、ELF2M、EMMPRIN、EpCam、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gp100、HAGE、HER-2/new、HLA-A*0201-R170I、HPV-E7、HSP70-2M、HST-2、hTERT、hTRT、iCE、IGF-1R、IL-2R、IL-5、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART-1/melan-A、MART-2/Ski、MC1R、Mesothelin、肌球蛋白/m、PSCA、GPC3、MUC1、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、PAP、蛋白酶-3、p190minorbcr-abl、Pml/RARα、PRAME、PSA、PSM、PSMA、RAGE、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、生存蛋白、TEL/AML1、TGFβ、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、VEGF、WT1、BCMA、CD123、PD-1、PD-L1/2、TIM3、LAG3、A2ARA2AR、B7H3、B7H4、BTLA、IDO、KIR、CD160、2B4、VISTA、TSHR、CD171、CS-1、CLL-1、GD3、TnAg、FLT3、CD38、...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：深圳市体内生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44