肺炎支原体嵌合抗原、该抗原检测试剂及两者的制备方法技术

本发明专利技术提供了肺炎支原体嵌合抗原氨基酸序列，包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，及全基因合成的肺炎支原体嵌合抗原的全基因序列，包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。本发明专利技术还提供了构建上述两个基因序列的方法。本发明专利技术还提供了上述包含全基因合成的肺炎支原体嵌合抗原的制备方法、该肺炎支原体检测试剂及制备方法。本发明专利技术选择Mp重组嵌合抗原作为标记材料，并应用于金标免疫层析系统，该检测体系为直接标记捕获，灵敏度有较大幅度的提高，而抗原其特异性提高，且其抗原易于培养纯化，更加节约成本；为临床提供一种既快速又能准确检测肺炎支原体IgG的新方法，具有良好的市场前景。

【技术实现步骤摘要】
肺炎支原体嵌合抗原、该抗原检测试剂及两者的制备方法
本专利技术体外诊断免疫检测领域，特别涉及肺炎支原体，以及肺炎支原体的嵌合抗原表达载体的构建、嵌合重组抗原的表达、制备，还涉及含有该抗原或抗原组合物的试剂盒和应用。
技术介绍
肺炎支原体（mycoplasmapneuoniae,MP）是介于细菌和病毒之间的一种超过滤性病原微生物，主要通过呼吸道飞沫以气溶胶微粒的形式传播。1962年首先从人类原发性非典型肺炎（primaryatypicalpneumonia,PAP）患者的痰液中分离和培养而来。20世纪90年代以来，随着肺炎病原学的变迁，MP已成为小儿肺炎的重要病原体，MP感染不仅引起肺部病变，且能侵犯心、脑、肝肾等其他器官，引起多种肺外表现。MP还是社区获得性肺炎（CAP）的重要病原，尤其是5岁以上小儿，MP在非流行年占CAP病原10~20%。因MP生长缓慢、潜伏期及带菌时间长，形成间歇发病缓慢、长时期传播的流行特点，流行可达数月至数年。近些年来，流感人群比例逐年增加，不仅侵犯青少年和儿童，婴幼儿发病率也呈增多趋势，且由于MP感染常无特异性临床表现，容易与一般的病毒性感冒相混淆。因此，能够及时确诊何种病因致病，做到早发现早治疗，减少儿童急性肺炎病情恶化，故早期诊断极为重要。肺炎支原体抗体分为IgG抗体和IgM抗体两种，因为肺炎支原体感染的潜伏期为2周-3周，当患者出现症状而就诊时，IgM抗体已达到相当高的水平，因此IgM抗体阳性可作为急性期感染的诊断指标。如IgM抗体阴性，也不能否定肺炎支原体感染，还需检测IgG抗体。IgG较IgM出现晚，需动态观察。肺炎支原体IgG抗体的测定，同时结合肺炎支原体IgM抗体的检测，可用于辅助诊断支原体肺炎等疾病。间接法检测人血清中特异的抗MP的IgG与IgM，在目前应用较多。优点是方便快捷，技术操作简单，对实验设备要求低，适合大规模检测。但国内至今尚无令人满意的免疫层析检测试剂盒。研制高质量的免疫层析检测试剂盒，最重要的是选用抗原性强、特异性好的抗原。我国目前使用的MP抗原多是培养的MP提取物，常混有其它蛋白产物，所以抗原特异性不强，容易产生假阳性。应用基因工程技术大量制备高纯度重组抗原是一种比较经济、实用的方法。随着分子生物学技术不断发展，越来越多的的MP主要抗原基因相继被克隆。这些基因表达的重组蛋白，表达纯化后可作为抗原包被，用于抗MP抗体检测。但是要筛选出抗原性好、表达量较高易于纯化的抗原，有一定困难。用重组嵌合抗原作为血清检测抗原可以克服多个基因重组抗原制备复杂、非特异性强及难以纯化的缺点，价廉、安全、快速且重复性好。国外的研究证实MP的P1蛋白和P30蛋白具有较强的抗原性，在MP感染者的血清中抗体检出率较高，但也有两个缺点，一个是假阳性较高，另一个就是制备过程复杂。大量研究证明P1对应的B细胞表位属于空间构象特异性表位，蛋白属于线性表位。我们构建了MP多抗原表位序列的嵌合抗原，疫层析检测显示构建的嵌合抗原具有良好的抗原活性，其检测的灵敏度和特异性较市面上的产品的性能都有较大提高。
技术实现思路
本专利技术首先所要解决的技术问题是提供一种肺炎支原体嵌合抗原氨基酸序列，包含如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。本专利技术其次所要解决的技术问题是提供一种全基因合成的肺炎支原体嵌合抗原的全基因序列，包含如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。本专利技术还要解决的技术问题是提供一种构建首先是构建肺炎支原体嵌合抗原氨基酸序列的方法，步骤如下：S101利用计算机软件分析肺炎支原体蛋白的全部氨基酸序列，筛选出肺炎支原体蛋白中包含抗原性的蛋白序列P1：residues1177-1535、P30蛋白的抗原表位：residues170–254和MPN456蛋白的抗原表位：residues765–846，并用柔性多肽互相连接。在该基础上，本专利技术还提供了一种构建全基因合成的肺炎支原体嵌合抗原的全基因序列的方法，步骤在上述S101基础上还有如下步骤：根据肺炎支原体基因，采用全基因合成方法，在其5′和3′端分别加上CATATG和AAGCTT以分别获得内切酶NdeⅠ和HindⅢ的酶切识别位点CATATG和AAGCTT，序列长度1668bp，将在细菌中稀有密码子替换成细菌偏爱密码子并连接在pGEM-TVector（Promega公司产品）载体上，获得肺炎支原体嵌合抗原的全基因序列。同时，本专利技术还提供了上述包含全基因合成的肺炎支原体嵌合抗原的制备方法，包括如下步骤：S301利用计算机软件分析肺炎支原体蛋白的全部氨基酸序列，该计算机软件可以选择ANTHEWIN等，筛选出肺炎支原体蛋白中包含抗原性的蛋白序列P1：residues1177-1535、P30蛋白的抗原表位：residues170–254和MPN456蛋白的抗原表位：residues765–846，并用柔性多肽互相连接，上述蛋白序列为抗原性较强的蛋白序列；S302根据肺炎支原体基因，采用全基因合成方法，在其5′和3′端分别加上CATATG和AAGCTT以分别获得内切酶NdeⅠ和HindⅢ的酶切识别位点CATATG和AAGCTT，序列长度1668bp，将在细菌中稀有密码子替换成细菌偏爱密码子并连接在pGEM-TVector（Promega公司产品）载体上，获得肺炎支原体嵌合抗原的全基因序列；S303将上述步骤获得的含肺炎支原体基因质粒载体1μg用限制性内切酶HindⅢ/NdeⅠ进行双酶切，酶切产物与用同样酶切的1μg载体pET28a（+），1%琼脂糖电泳，且胶回收目的片段和载体片段，1%琼脂糖电泳检测回收片段的量，按相对分子数目的片段：载体片段=4:1混合，加入5μgT4连接酶16°C连接过夜，取5μl连接产物转化100μl预制好的DH5a感受态细胞，涂布抗性LB平板，37°C倒置培养过夜，挑选含有阳性质粒的克隆，将得到的含有肺炎支原体的重组表达载体对的克隆命名为pET28a-MP。进一步的，还包括步骤：将待鉴定含重组表达载体pET28a-MP克隆小量培养，碱法快速抽提质粒，用限制性内切酶HindⅢ/NdeⅠ进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖电泳检测，可测得一条大小为1668bp的肺炎支原体基因。该全基因合成方法合成嵌合基因的序列，表达出重组嵌合抗原，解决现有的免疫层析检测抗原特异性不强，灵敏度不高的问题。进一步的，该肺炎支原体的重组表达载体的诱导表达过程和扩大培养过程如下，诱导表达：重组表达载体pET28a-MP转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，在含有卡那霉素的LB培养平板上培养，挑选单菌落接种到5mlLB培养基中筛选得到的阳性重组菌进行诱导表达，产物进行SDS-PAGE分析；扩大培养：接种经过SDS-PAGE鉴定有目的蛋白表达的工程菌单菌落到200ml含kanamycin的LB三角瓶，200rpm，37°C震荡培养过夜，次日，按5%接种量，接种到400mlLB含kanamycin的1L三角瓶中，37°C，240rpm震荡培养至OD600=0.5，置冰水浴冷却至22°C，加入IPTG诱导肺炎支原体基因表达，其中，IPTG的浓度为0.01mM，诱导时间为6小时，震荡速度为240rpm/min。本专利技术另外又提供了一种肺炎支原体检测试剂条，所述试剂本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肺炎支原体嵌合抗原氨基酸序列，其特征在于包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种肺炎支原体嵌合抗原氨基酸序列，其特征在于包含如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。2.一种全基因合成的肺炎支原体嵌合抗原的全基因序列，其特征在于包含如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。3.一种构建如权利要求1所述的肺炎支原体嵌合抗原氨基酸序列的方法，其特征在于它包括如下步骤：S101筛选出肺炎支原体蛋白中包含抗原性的蛋白序列P1：residues1177-1535、P30蛋白的抗原表位：residues170–254和MPN456蛋白的抗原表位：residues765–846，并用柔性多肽互相连接。4.一种构建如权利要求2所述的全基因合成的肺炎支原体嵌合抗原的方法，其特征在于它包括如下步骤：S201筛选出肺炎支原体蛋白中包含抗原性的蛋白序列P1：residues1177-1535、P30蛋白的抗原表位：residues170–254和MPN456蛋白的抗原表位：residues765–846，并用柔性多肽互相连接；S202根据肺炎支原体基因，采用全基因合成方法，在其5′和3′端分别加上CATATG和AAGCTT以分别获得内切酶NdeⅠ和HindⅢ的酶切识别位点CATATG和AAGCTT，序列长度1668bp，将在细菌中稀有密码子替换成细菌偏爱密码子并连接在pGEM-TVector载体上，获得肺炎支原体嵌合抗原的全基因序列。5.一种如权利要求2或4所述的肺炎支原体嵌合抗原的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：S301筛选出肺炎支原体蛋白中包含抗原性的蛋白序列P1：residues1177-1535、P30蛋白的抗原表位：residues170–254和MPN456蛋白的抗原表位：residues765–846，并用柔性多肽互相连接；S302根据肺炎支原体基因，采用全基因合成方法，在其5′和3′端分别加上CATATG和AAGCTT以分别获得内切酶NdeⅠ和HindⅢ的酶切识别位点CATATG和AAGCTT，序列长度1668bp，将在细菌中稀有密码子替换成细菌偏爱密码子并连接在pGEM-TVector载体上，获得肺炎支原体嵌合抗原的全基因序列；S303将上述步骤获得的含肺炎支原体基因质粒载体1μg用限制性内切酶HindⅢ/NdeⅠ进行双酶切，酶切产物与用同样酶切的1μg载体pET28a（+），1%琼脂糖电泳，且胶回收目的片段和载体片段，1%琼脂糖电泳检测回收片段的量，按相对分子数目的片段：载体片段=4:1混合，加入5μgT4连接酶16°C连接过夜，取5μl连接产物转化100μl预制好的DH5a感受态细胞，涂布抗性LB平板，37°C倒置培养过夜，挑选含有阳性质粒的克隆，将得到的含有肺炎支原体的重组表达载体对的克隆命名为pET28a-MP。6.如权利要求5所述的肺炎支原体嵌合抗原的制备方法，其特征在于在步骤S303后还包括如下重组表达载体的酶切鉴定步骤：将待鉴定含重组表达载体pET28a-MP克隆小量培养，碱法快速抽提质粒，用限制性内切酶HindⅢ/NdeⅠ进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖电泳检测，可测得一条大小为1668bp的肺炎支原体基因。7.一种肺炎支原体检测试剂条，所述试剂条包括PVC板及粘贴在PVC板上的NC膜、金标...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷秀飞，郑曙剑，刘静，
申请(专利权)人：杭州隆基生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33