制备嵌合抗原受体表达细胞的方法技术

本发明专利技术提供了可以进行工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)的制备方法，以及包含所述细胞的组合物和反应混合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备嵌合抗原受体表达细胞的方法本申请要求2014年12月29日提交的美国序列号62/097,375和2015年3月13日提交的美国序列号62/133,137的优先权，其全部内容通过引用并入本文。序列表本申请包含已经以ASCII格式电子提交的序列表，并通过引用整体并入本文。所述ASCII拷贝创建于2015年12月18日，名称为N2067-7067WO_SL.txt，大小为246,147字节。
本专利技术一般涉及制备工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)的方法和包含所述免疫效应细胞的组合物。
技术介绍
采用自体T细胞，特别是用嵌合抗原受体(CAR)转导的T细胞的继承性细胞转移(ACT)疗法已经在一些血液癌症试验中显示出希望。专利技术概述本公开涉及制备可被工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)的方法和包含所述免疫效应细胞的组合物。因此，在一个方面，本公开的特征在于制备可以被工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)群体的方法，所述方法包括提供免疫效应细胞(例如，T细胞)群体，从群体中除去T调节细胞，例如CD25+T细胞，从而提供适合于表达CAR的T调节性消耗细胞，例如CD25+消耗的细胞的群体。在一个实施方案中，T调节性消耗细胞的群体含有少于30％,25％,20％,15％,10％,5％,4％,3％,2％,1％的CD25+细胞。在一个实施方案中，免疫效应细胞群体是具有癌症的受试者的细胞，例如具有表达CD25的癌症例如慢性淋巴细胞白血病(CLL)的受试者的细胞。在一个实施方案中，T调节性消耗细胞的群体含有少于50％,40％,30％,25％,20％,15％,10％,5％,4％,3％,2％,1％的CD25+细胞和少于50％,40％,30％,25％,20％,15％,10％,5％,4％,3％,2％,1％的肿瘤细胞。在一个实施方案中，免疫效应细胞群体对于将被给予细胞用于治疗的受试者是自体的。在一个实施方案中，免疫效应细胞群体与将被给予细胞用于治疗的受试者是同种异体的。在一个实施方案中，使用抗-CD25抗体或其片段或CD25结合配体例如IL-2，从群体中除去T调节细胞，例如CD25+T细胞。在一个实施方案中，抗CD25抗体或其片段或CD25结合配体与基质(例如珠粒)缀合，或以其它方式包被在基质(例如珠粒)上。在一个实施方案中，抗CD25抗体或其片段与本文所述的基质缀合。在一个实施方案中，使用抗CD25抗体分子或其片段从群体中除去T调节细胞，例如CD25+T细胞。在一个实施方案中，使用来自MiltenyiTM的CD25消耗试剂从群体中除去T调节细胞，例如CD25+T细胞。在一个实施方案中，细胞与CD25消耗试剂的比例为1e7个细胞对20uL，或1e7个细胞对15μL，或1e7个细胞对10uL，或1e7个细胞对5uL，或1e7个细胞对2.5uL，或1e7个细胞对1.25uL。在一个实施方案中，T调节性消耗细胞，例如CD25+消耗的细胞的群体适合于表达本文所述的CAR，例如本文所述的CD19CAR。在一个实施方案中，免疫效应细胞群体获自具有血液癌症的受试者，所述癌症为例如白血病，例如慢性淋巴细胞白血病(CLL)，急性淋巴细胞白血病(ALL)或淋巴瘤，例如外套细胞淋巴瘤(MCL)或霍奇金淋巴瘤(HL)。在一个实施方案中，T调节性消耗细胞的群体含有少于30％,25％,20％,15％,10％,5％,4％,3％,2％,1％的白血病细胞，例如，CLL细胞，ALL细胞或淋巴瘤细胞，例如MCL细胞或HL细胞。在一个实施方案中，从具有CLL的受试者获得免疫效应细胞群体，并且T调节性消耗细胞群体，例如CD25+消耗细胞的群体含有少于30％,25％,20％,15％,10％,5％,4％,3％,2％,1％的白血病细胞，例如CLL细胞，并且适合于本文所述的CD19CAR的表达。在一个实施方案中，T调节性消耗细胞的群体含有少于15％,10％,5％,4％,3％,2％,1％的CD25+细胞，和少于15％,10％,5％,4％,3％,2％,1％的肿瘤细胞，例如表达CD25的肿瘤细胞，例如CLL细胞。在一个实施方案中，T调节性消耗细胞的群体含有少于10％,5％,4％,3％,2％,1％的CD25+细胞，和少于10％，5％，4％，3％2％，1％的肿瘤细胞，例如表达CD25的肿瘤细胞，例如CLL细胞。在一个实施方案中，免疫效应细胞群体是从外周血淋巴细胞分离的T细胞。在一个实施方案中，通过裂解红细胞和/或通过消耗单核细胞获得T细胞群体。在一个实施方案中，使用例如本文所述的方法从外周淋巴细胞分离T细胞群体。在一个实施方案中，免疫效应细胞群体可以从受试者的血液样品中获得，例如通过单采血液成分术获得。在一个实施方案中，通过单采血液成分术收集的细胞被洗涤以除去血浆部分，并且任选地，将细胞提供在适当的缓冲液或培养基中用于随后的加工步骤。在一个实施方案中，用缓冲液例如磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一个实施方案中，细胞在缺乏一种或多种二价阳离子例如钙和镁，例如缺少钙和镁两者的洗涤溶液中洗涤。在一个实施方案中，将细胞在基本上不含二价阳离子的缓冲液中洗涤。在一个实施方案中，所述方法还包括从表达肿瘤抗原(例如，不包含CD25，例如CD19，CD30，CD38，CD123，CD20，CD14或CD11b的肿瘤抗原)的群体移除细胞，从而提供T调节消耗的，例如CD25+消耗的的群体，以及适合于表达CAR，例如本文所述的CAR的肿瘤抗原消耗的细胞。在一个实施方案中，肿瘤抗原表达细胞与T调节的，例如CD25+细胞被同时除去。例如，抗CD25抗体或其片段和抗肿瘤抗原抗体或其片段可以连接到相同的基质，例如可用于除去细胞的珠粒或抗CD25抗体或其片段或抗肿瘤抗原抗体或其片段可以连接到分离的珠粒上，其混合物可用于除去细胞。在其它实施方案中，T调节细胞例如CD25+细胞的去除以及肿瘤抗原表达细胞的去除是顺序的，并且可以以任一顺序发生。在一个实施方案中，所述方法还包括从表达检查点抑制剂，例如本文所述的检查点抑制剂的群体中移除细胞，例如PD1+细胞，LAG3+细胞和TIM3+细胞中的一种或多种(例如，2或3种)，从而提供T调节消耗的，例如CD25+消耗的细胞和检查点抑制剂消耗的细胞，例如PD1+，LAG3+和/或TIM3+消耗的细胞的群体。在实施方案中，去除PD1+细胞和LAG3+细胞；去除PD1+细胞和TIM3+细胞；或去除LAG3+和TIM3+细胞。在一个实施方案中，与T调节性例如CD25+细胞同时除去检查点抑制剂表达细胞。例如，可以将抗CD25抗体或其片段和抗检查点抑制剂抗体或其片段连接到可用于除去细胞的相同珠粒上，或抗CD25抗体，或其片段，和抗检查点抑制剂抗体或其片段可以连接到分离的珠粒上，其混合物可用于除去细胞。在其它实施方案中，T调节细胞(例如CD25+细胞)的去除以及检查点抑制剂表达细胞的去除是顺序的，并且可以以任一顺序发生。在一个实施方案中，要除去的细胞群既不是调节性T细胞或肿瘤细胞，而是另外的负面影响CART细胞的扩增和/或功能的细胞，例如，表达CD14，CD11b，CD33，CD15或潜在免疫抑制细胞表达的其他本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备消耗了T调节细胞并可被工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)群体的方法，所述方法包括：提供免疫效应细胞(例如，T细胞)群体，和从群体中除去T调节细胞，例如CD25+T细胞，从而提供适合于表达CAR的T调节性消耗的细胞，例如CD25+消耗的细胞群体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.29 US 62/097,375;2015.03.13 US 62/133,1371.一种制备消耗了T调节细胞并可被工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)群体的方法，所述方法包括：提供免疫效应细胞(例如，T细胞)群体，和从群体中除去T调节细胞，例如CD25+T细胞，从而提供适合于表达CAR的T调节性消耗的细胞，例如CD25+消耗的细胞群体。2.权利要求1的方法，其中所述T调节性消耗的细胞群体含有少于30％,25％,20％,15％,10％,5％,4％,3％,2％,1％的CD25+细胞。3.权利要求1的方法，其中所述免疫效应细胞群体是患有癌症，例如患有表达CD25的癌症，例如慢性淋巴细胞白血病(CLL)的受试者的细胞。4.权利要求3的方法，其中所述T调节性消耗的细胞群体含有少于50％,40％,30％,25％,20％,15％,10％,5％,4％,3％,2％,1％的CD25+细胞和少于50％,40％,30％,25％,20％,15％,10％,5％,4％,3％,2％,1％的肿瘤细胞。5.权利要求1的方法，其中使用抗CD25抗体或其片段从群体中除去T调节细胞，例如CD25+T细胞。6.权利要求5的方法，其中所述抗CD25抗体或其片段与基质，例如珠粒缀合。7.权利要求3的方法，其中所述免疫效应细胞群体获自患有血液癌症，例如白血病，例如慢性淋巴细胞白血病(CLL)，急性淋巴细胞白血病(ALL)或淋巴瘤，例如，套细胞淋巴瘤(MCL)的受试者。8.权利要求7的方法，其中所述T调节性消耗的细胞群体含有少于30％,25％,20％,15％,10％,5％,4％,3％,2％,1％的白血病细胞，例如CLL细胞，ALL细胞或淋巴瘤细胞，例如MCL细胞，HL细胞，例如其中T调节性消耗的细胞群体含有少于15％,10％,5％,4％,3％,2％,1％的CD25+细胞和少于15％,10％,5％,4％,3％,2％,1％的肿瘤细胞，例如CLL细胞，例如，其中T调节性消耗的细胞群体含有少于10％,5％,4％,3％,2％,1％的CD25+细胞和少于10％,5％,4％,3％,2％,1％的肿瘤细胞，例如CLL细胞。9.权利要求1所述的方法，所述方法还包括：从群体中除去表达肿瘤抗原，例如不包含CD25，例如CD19，CD30，CD38，CD123，CD20，CD14或CD11b的肿瘤抗原的细胞，从而提供T调节性消耗的，例如，CD25+消耗的，以及肿瘤抗原消耗的适于表达CAR，例如本文所述的CAR的细胞的群体。10.权利要求1的方法，所述方法还包括从表达检查点抑制剂，例如，本文所述的检查点抑制剂的群体除去细胞，例如PD1+细胞，LAG3+细胞和TIM3+细胞中的一种或多种，从而提供T调节性消耗的细胞，例如CD25+消耗的细胞，以及检测点抑制剂消耗的细胞，例如PD1+，LAG3+和/或TIM3+消耗的细胞的群体。11.权利要求1的方法，其中提供的免疫效应细胞群体已经基于一种或多种标记物，例如CD3，CD28，CD4，CD8，CD45RA和CD45RO的表达进行选择，例如所提供的免疫效应细胞(例如，T细胞)群体是CD3+和/或CD28+。12.前述权利要求中任一项所述的方法，还包括：例如通过本文所述的方法活化T调节性消耗的细胞群体，例如CD25+消耗的细胞群体，和/或使用包含编码CAR，例如，本文所述的CAR，例如本文所述的CD19CAR的核酸的载体转导来自T调节性消耗的细胞群体，例如，CD25+消耗的细胞群体的细胞。13.权利要求12的方法，其还包括例如通过本文所述的方法扩增T调节性消耗的细胞的群体，例如所述细胞被工程以表达CAR，例如，本文所述的CAR，例如本文所述的CD19CAR。14.权利要求13的方法，其中所述细胞群体扩增8天或更少，例如7,6,5,4或3天，或其中所述细胞群体在培养物中扩增5天，并且所得细胞比在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞更有效，例如，其中与在相同培养条件下培养9天的相同细胞相比，扩增5天的细胞在抗原刺激时显示细胞倍增增加至少一倍，两倍，三倍或四倍，或者其中细胞在培养物中扩增5天，并且与在相同培养条件下培养9天的相同细胞相比，所得细胞表现出更高的促炎细胞因子产生，例如IFN-γ和/或GM-CSF水平。15.权利要求13的方法，其中通过在刺激CD3/TCR复合体相关信号的试剂和刺激例如，如本文所述细胞表面上的共刺激分子的配体的存在下培养细胞来扩增细胞群体。在一个实施方案中，试剂是与抗CD3抗体或其片段和/或抗-CD28抗体或其片段缀合的珠粒。16.权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述细胞群体在包括一种或多种白介素的合适培养基(例如，本文所述的培养基)中扩增，所述白介素导致在14天的扩增期内细胞的至少200倍(例如200倍，250倍，300倍，350倍)增加，例如，通过本文所述的方法，例如流式细胞术测量，例如，其中细胞群体在IL-15和/或IL-7(例如，IL-15和IL-7)存在下扩增。17.权利要求13-16中任一项所述的方法，其中所述细胞群体在适当的扩增期后冷冻保存。18.前述权利要求中任一项的方法，还包括使所述免疫效应细胞群体与编码端粒酶亚基，例如hTERT的核酸接触，并且其中所述核酸是例如DNA或RNA。19.一种反应混合物，其包含含有少于50％,40％,30％,25％,20％,15％,10％,5％,4％,3％,2％,1％的CD25+细胞的T调节性消耗的细胞群体。20.一种反应混合物，其包含含有少于50％,40％,30％,25％,20％,15％,10％,5％,4％,3％,2％,1％的CD25+细胞和少于50％,40％,30％,25％,20％,15％,10％,5％,4％,3％,2％,1％的表达CD25的肿瘤细胞，例如CLL细胞的T调节性消耗的细胞群体。21.权利要求20的反应混合物，其中所述细胞群体含有少于15％,10％,5％,4％,3％,2％,1％的CD25+细胞和少于15％,10％,5％,4％,3％,2％,1％的肿瘤细胞，例如表达CD25的肿瘤细胞，例如CLL细胞，或其中所述细胞群体含有少于10％,5％,4％,3％,2％,1％的CD25+细胞和少于10％,5％,4％,3％,2％,1％的肿瘤细胞，例如表达CD25的肿瘤细胞，例如CLL细胞。22.权利要求20-21中任一项所述的反应混合物，其中所述反应混合物包含含有少于50％,40％,30％,25％,20％,15％,10％,5％,4％,3％,2％,1％的CD25+细胞和少于50％,40％,30％,25％,20％,15％,10％,5％,4％,3％,2％,1％的检测点抑制剂表达细胞，例如PD1+细胞，LAG3+细胞或TIM3+细胞的T调节性消耗的细胞群体。23.权利要求19-22中任一项所述的反应混合物，其中所述反应混合物还包含活化...

【专利技术属性】
技术研发人员：F·贝多亚，S·卡西米，C·H·琼，B·L·莱维内，J·J·梅勒霍斯特，M·C·米伦，D·J·小鲍威尔，Z·郑，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，宾夕法尼亚大学托管会，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH