一种能产生抗卡痛单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物检测领域，本发明专利技术公开了一种能产生抗卡痛单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法和应用。该杂交瘤细胞株命名为Kratom11B7，已于2021年1月31日保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏号为CCTCCNO：C202146。其制备方法包括：步骤1：帽柱木碱完全抗原的制备；步骤2：7羟基帽柱木碱完全抗原的制备；步骤3：杂交瘤细胞株的制备：用帽柱木碱完全抗原和7羟基帽柱木碱完全抗原共同免疫小鼠。本发明专利技术杂交瘤细胞株Kratom11B7分泌产量高，分泌得到的抗卡痛单克隆抗体具有高亲和力、高特异性、高灵敏度特点。本发明专利技术采用连续免疫法，可有效节省抗原用量、缩短免疫时间。缩短免疫时间。

【技术实现步骤摘要】
一种能产生抗卡痛单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物检测领域，尤其涉及一种能产生抗卡痛单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]卡痛，茜草科，是一种生长在东南亚的精神活性植物，特别是在泰国和马来西亚。.新鲜或者干燥的卡痛叶可以通过吸食、咀嚼或泡茶食用。低剂量的卡痛有刺激作用，长期以来被东南亚体力劳动者作为兴奋剂来抵消工作疲劳使用；高剂量的卡痛具有镇静
‑
麻醉效果，所以卡痛叶被作为传统毒品和鸦片的替代品。
[0003]卡痛的药理功能主要是通过生物碱7
‑
羟基帽柱木碱(式II)和帽柱木碱(式I)实现的。虽然这些生物碱分子的结构和致幻剂相似，但是这些物质没有致幻剂活性。相反地，这些生物碱主要与肾上腺素和阿片受体相互作用。因此，常常用来阻止或缓解阿片类药物依赖患者的戒断症状，或者被用来降低对阿片类药物的依赖。由于卡痛叶的延缓戒断综合征作用，其也有一定的被滥用为毒品的风险。研究发现食用卡痛后会出现口干、出汗、头晕、排尿增加或减少、食欲下降以及恶心或呕吐。长期使用可能产生的副作用有厌食和体重下降、失眠、烦躁不安、睡眠障碍、出现幻觉以及产生依赖性。
[0004]据美国《纽约时报》，在泰国，卡痛叶的来源丰富，其生物碱的提前提取方法简单，现在流行一种卡痛叶制成的
″
毒品鸡尾酒
″
，很多青少年已经沦为卡痛叶成瘾者。通常将从卡痛叶中提取的汁液与止咳糖浆、可口可乐和冰块混合而成。卡痛在其天然状态下具有相对的安全性，高浓度的生物碱类提取物比未经加工的叶片更具危害性，而且，卡痛若与镇静剂如酒精等混合使用，有可能产生累加效应。与任何共同吞下的物质相互掺杂或污染也是风险之一。在欧洲，非法掺入了未公开的合成阿片受体激动剂O
‑
去甲基曲马多以及咖啡因等其他物质的某些品牌的卡痛已被曝光。2010～2011年瑞典有9人的死亡便与掺入了几种其他物质而非纯天然卡痛的卡痛制品有关。因此，建立特异性强，灵敏度高的卡痛检测抗体意义重大。

技术实现思路

[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种能产生抗卡痛单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法和应用。本专利技术杂交瘤细胞株Kratom11B7分泌产量高，分泌得到的抗卡痛单克隆抗体能同时检测帽柱木碱和7
‑
羟基帽柱木碱，能更好的检测食用卡痛叶、卡痛叶提取物及其衍生物。且其具有高亲和力、高特异性、高灵敏度特点。本专利技术采用连续免疫法，可有效节省抗原用量、缩短免疫时间。
[0006]本专利技术的具体技术方案为：第一方面，本专利技术提供了一种能产生抗卡痛单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其命名为杂交瘤细胞株Kratom11B7，已于2021年1月31日保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏号
为CCTCCNO：C202146。
[0007]第二方面，本专利技术提供了一种杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：步骤1：帽柱木碱完全抗原的制备：以帽柱木碱为原料，先用三氟乙酸酐保护仲胺基，再用氢氧化锂水解甲酯得到羧基，在羧基位点引入5
‑
氨基戊酸增加臂长，得到帽柱木碱半抗原，通过碳二亚胺法使帽柱木碱半抗原偶联载体蛋白后，脱去保护基，得到帽柱木碱完全抗原。
[0008]现有的卡痛全抗原活性较低。例如专利CN108732345A公开了一种检测人唾液中帽柱木碱及其衍生物和代谢物的检测试纸及制备方法，该帽柱木碱通过在苯环上引入丁二酸酐形成帽柱木碱半琥珀酸酯衍生物，使其能与牛血清蛋白偶联制成全抗原。但是本专利技术团队通过研究发现，帽柱木碱中仲胺基是抗原的重要活性基团，在上述方法中仲胺基未得到保护，引入丁二酸酐时会出现两个位点，偶联位点不明，导致其活性较低。此外，引入的支链(该支链用于偶联载体蛋白)臂长过短，容易导致大分子载体蛋白覆盖活性位点而无法保留卡痛分子中的活性基团，故获得的全抗原存在抗原活性低、特异性差、灵敏度低的问题。
[0009]采用本专利技术的方法制备帽柱木碱完全抗原和7羟基帽柱木碱完全抗原，一方面能比较完整地保留的分子结构以及帽柱木碱抗原活性基团胺基和7羟基帽柱木碱抗原的活性基团羟基，另一方面通过增加支链长度以避免偶联载体蛋白后活性位点被覆盖(支链的长度需要在4
‑
6个碳原子的直链最佳，过长会增加抗原决定簇，过短可能会覆盖小分子的抗原决定簇)，使获得的抗原具有较强的特异性和较高的灵敏度。此外，本专利技术的方法工艺步骤简单，反应收率较高，反应条件温和，且不需要使用毒性和腐蚀性较强的试剂。
[0010]步骤2：7羟基帽柱木碱完全抗原的制备：以7羟基帽柱木碱为原料，用氢氧化锂水解甲酯得到羧基，在羧基位点引入5
‑
氨基戊酸增加臂长，得到7羟基帽柱木碱半抗原，通过碳二亚胺法使7羟基帽柱木碱半抗原偶联载体蛋白后，得到7羟基帽柱木碱完全抗原。
[0011]步骤3：杂交瘤细胞株的制备：用帽柱木碱完全抗原和7羟基帽柱木碱完全抗原共同免疫小鼠，得到杂交瘤细胞株Kratom11B7。
[0012]“连续增强刺激法”免疫方法，具有抗原用量少、免疫时间短、稳定性好、亲和力强等优点。
[0013]作为优选，步骤3中，所述杂交瘤细胞株通过皮下免疫、静脉免疫结合的连续增强刺激免疫方法获得。
[0014]作为优选，步骤3包括：步骤3.1：免疫；步骤3.2：脾细胞与骨髓瘤细胞的融合；步骤3.3：杂交瘤细胞的筛选。
[0015]作为优选，步骤3.1具体为：将帽柱木碱完全抗原和7羟基帽柱木碱完全抗原按质量比(0.8
‑
1.2)：1混合，然后用PBS缓冲液稀释浓度为0.8
‑
1.2mg/ml；第1天免疫再将稀释后的抗原和完全佐剂按质量比(0.8
‑
1.2)：1混合，在小鼠皮下注射3
‑
7ug/只，第6天用不完全佐剂混合抗原，在小鼠淋巴结附近注射8
‑
12ug/只，第11天在小鼠淋巴结附近注射13
‑
17ug/只，第16天在小鼠淋巴结附近注射18
‑
22ug/只，第21天在小鼠淋巴结附近注射23
‑
27ug/只，第24天在小鼠静脉直接注射3
‑
7ug/只。
[0016]作为优选，步骤3.2具体为：步骤3.2.1：饲养细胞悬液制备：小鼠摘眼球放血处死，浸泡于酒精中消毒，撕开小鼠腹外皮肤，暴露其腹膜，注入35
‑
40℃预热的DMEM无血清培养基，轻揉小鼠腹腔1
‑
2分钟，悬浮腹腔细胞，吸出腹腔液；剪开小鼠胸腔取胸腺研磨后收集悬液，与腹腔液合并离心，沉淀物用HAT完全培养液重悬，得到饲养细胞悬液；步骤3.2.2：小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：把小鼠骨髓瘤细胞SP2/0用含体积分数为8
‑
12％FBS的DMEM培养基进行传代培养，细胞融合前一天进行传代以保证小鼠骨髓瘤细胞SP2/0适合生长本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种能产生抗卡痛单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：其命名为杂交瘤细胞株Kratom 11B7，已于2021年1月31日保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏号为CCTCCNO：C202146。2.一种如权利要求1所述杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于包括以下步骤：步骤1：帽柱木碱完全抗原的制备：以帽柱木碱为原料，先用三氟乙酸酐保护仲胺基，再用氢氧化锂水解甲酯得到羧基，在羧基位点引入5
‑
氨基戊酸增加臂长，得到帽柱木碱半抗原，通过碳二亚胺法使帽柱木碱半抗原偶联载体蛋白后，脱去保护基，得到帽柱木碱完全抗原；步骤2：7羟基帽柱木碱完全抗原的制备：以7羟基帽柱木碱为原料，用氢氧化锂水解甲酯得到羧基，在羧基位点引入5
‑
氨基戊酸增加臂长，得到7羟基帽柱木碱半抗原，通过碳二亚胺法使7羟基帽柱木碱半抗原偶联载体蛋白后，得到7羟基帽柱木碱完全抗原；步骤3：杂交瘤细胞株的制备：用帽柱木碱完全抗原和7羟基帽柱木碱完全抗原共同免疫小鼠，得到杂交瘤细胞株Kratom11B7。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤3中，所述杂交瘤细胞株通过皮下免疫、静脉免疫结合的连续增强刺激免疫方法获得。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤3包括：步骤3.1：免疫；步骤3.2：脾细胞与骨髓瘤细胞的融合；步骤3.3：杂交瘤细胞的筛选。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤3.1具体为：将帽柱木碱完全抗原和7羟基帽柱木碱完全抗原按质量比（0.8
‑
1.2）:1混合，然后用PBS缓冲液稀释浓度为0.8
‑
1.2mg/ml；第1天免疫再将稀释后的抗原和完全佐剂按质量比（0.8
‑
1.2）:1混合，在小鼠皮下注射3
‑
7ug/只，第6天用不完全佐剂混合抗原，在小鼠淋巴结附近注射8
‑
12ug/只，第11天在小鼠淋巴结附近注射13
‑
17ug/只，第16天在小鼠淋巴结附近注射18
‑
22ug/只，第21天在小鼠淋巴结附近注射23
‑
27ug/只，第24天在小鼠静脉直接注射3
‑
7ug/只。6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤3.2具体为：步骤3.2.1：饲养细胞悬液制备：小鼠摘眼球放血处死，浸泡于酒精中消毒，撕开小鼠腹外皮肤，暴露其腹膜，注入35
‑
40℃预热的DMEM无血清培养基，轻揉小鼠腹腔1
‑
2分钟，悬浮腹腔细胞，吸出腹腔液；剪开小鼠胸腔取胸腺研磨后收集悬液，与腹腔液合并离心，沉淀物用HAT完全培养液重悬，得到饲养细胞悬液；步骤3.2.2：小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：把小鼠骨髓瘤细胞SP2/0用含体积分数为8
‑
12﹪FBS的DMEM培养基进行传代培养，细胞融合前一天进行传代以保证小鼠骨髓瘤细胞SP2/0适合生长对数期，生长状态良好用于细胞融合；步骤3.2.3：脾细胞制备：将上述免疫的小鼠处死，泡酒精中消毒后剖腹，无菌取出脾脏，将脾脏放在连接着离心管的滤网上，立即加入无血清的DMEM培养液，用眼科剪剪碎脾脏，然后用无菌注射器柄轻磨脾脏，使脾脏细胞经过网孔滤入离心管内，加无血清培养液，离心；弃上清用无血清培养液重复离心，待用；步骤3.2.4：脾细胞与骨髓瘤细胞融合：将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合均匀，离
心洗涤细胞，去除上清液，置于35
‑
40℃水浴，加入0.5
‑
1.0ml35
‑
40℃预温的PEG4000，一分钟内加完，然后静止80
‑
100秒；再加入20
‑
30ml35
‑
40℃预温的DMEM无血清培养液终止PEG作用；离心，取沉淀；然后在沉淀中加入饲养细胞悬液，接种到96孔细胞培养板中，置于35
‑
40℃，3
‑
7﹪CO2培养箱中培养；20
‑
30小时后，采用HAT培养基，HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液，获得融合细胞。7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤3.3具体为：步骤3.3.1：初筛：融合细胞隔2
‑
4天后换液一次，观察96孔细胞培养板里的融合细胞生长情况，在细胞生长到细胞团簇时，吸取融合细胞培养上清液，采用间接ELISA方法筛选阳性克隆；用帽柱木碱完全抗原和7羟基帽柱木碱完全抗原分别作为包被抗原，筛选ELISA两者都是阳性的细胞进行复筛；步骤3.3.2：复筛：将筛选到的阳性克隆进一步用帽柱木碱和7羟基帽柱木碱标准品来竞争抑制ELISA方法进行复筛，筛选出竞争抑制率最高的杂交瘤细胞株做克隆培养；步骤3.3.3：杂交瘤细胞株kratom的克隆化：杂交瘤细胞株的克隆化培养按有限稀释法进行，准确计数细胞，用含8
‑
12﹪FBS的DMEM培养基稀释成3
‑
5个/ml的细胞悬液，然后以每孔200μl稀释后的细胞悬液接种到96孔细胞培...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑智彪，郑曙剑，
申请(专利权)人：杭州隆基生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：