一种抗卡痛单克隆抗体及用于检测卡痛的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及生物检测领域，本发明专利技术公开了一种抗卡痛单克隆抗体及用于检测卡痛的试剂盒。本发明专利技术的抗卡痛单克隆抗体由杂交瘤细胞株Kratom11B7分泌得到，能同时检测帽柱木碱和7‑羟基帽柱木碱，能更好的检测食用卡痛叶、卡痛叶提取物及其衍生物。且其具有高亲和力、高特异性、高灵敏度特点。采用本发明专利技术的试剂盒检测唾液中的卡痛，与现有的其它产品相比，在灵敏度、特异性、检出限等方面都更有优势。

【技术实现步骤摘要】
一种抗卡痛单克隆抗体及用于检测卡痛的试剂盒
本专利技术涉及生物检测领域，尤其涉及一种抗卡痛单克隆抗体及用于检测卡痛的试剂盒。
技术介绍
卡痛，茜草科，是一种生长在东南亚的精神活性植物，特别是在泰国和马来西亚。.新鲜或者干燥的卡痛叶可以通过吸食、咀嚼或泡茶食用。低剂量的卡痛有刺激作用，长期以来被东南亚体力劳动者作为兴奋剂来抵消工作疲劳使用；高剂量的卡痛具有镇静-麻醉效果，所以卡痛叶被作为传统毒品和鸦片的替代品。卡痛的药理功能主要是通过生物碱7-羟基帽柱木碱(式II)和帽柱木碱(式I)实现的。虽然这些生物碱分子的结构和致幻剂相似，但是这些物质没有致幻剂活性。相反地，这些生物碱主要与肾上腺素和阿片受体相互作用。因此，常常用来阻止或缓解阿片类药物依赖患者的戒断症状，或者被用来降低对阿片类药物的依赖。由于卡痛叶的延缓戒断综合征作用，其也有一定的被滥用为毒品的风险。研究发现食用卡痛后会出现口干、出汗、头晕、排尿增加或减少、食欲下降以及恶心或呕吐。长期使用可能产生的副作用有厌食和体重下降、失眠、烦躁不安、睡眠障碍、出现幻觉以及产生依赖性。据美国《纽约时报》，在泰国，卡痛叶的来源丰富，其生物碱的提前提取方法简单，现在流行一种卡痛叶制成的″毒品鸡尾酒″，很多青少年已经沦为卡痛叶成瘾者。通常将从卡痛叶中提取的汁液与止咳糖浆、可口可乐和冰块混合而成。卡痛在其天然状态下具有相对的安全性，高浓度的生物碱类提取物比未经加工的叶片更具危害性，而且，卡痛若与镇静剂如酒精等混合使用，有可能产生累加效应。与任何共同吞下的物质相互掺杂或污染也是风险之一。在欧洲，非法掺入了未公开的合成阿片受体激动剂O-去甲基曲马多以及咖啡因等其他物质的某些品牌的卡痛已被曝光。2010～2011年瑞典有9人的死亡便与掺入了几种其他物质而非纯天然卡痛的卡痛制品有关。因此，建立特异性强，灵敏度高的卡痛检测试剂盒意义重大。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种抗卡痛单克隆抗体及用于检测卡痛的试剂盒。本专利技术的抗卡痛单克隆抗体由杂交瘤细胞株Kratom11B7分泌得到，能同时检测帽柱木碱和7-羟基帽柱木碱，能更好的检测食用卡痛叶、卡痛叶提取物及其衍生物。且其具有高亲和力、高特异性、高灵敏度特点。采用本专利技术的试剂盒检测唾液中的卡痛，与现有的其它产品相比，在灵敏度、特异性、检出限等方面都更有优势。本专利技术的具体技术方案为：第一方面，本专利技术提供了一种抗卡痛单克隆抗体，由杂交瘤细胞株分泌而得，所述杂交瘤细胞株命名为Kratom11B7，已于2021年1月31日保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏号为CCTCCNO：C202146。进一步地，所述抗卡痛单克隆抗体属于IgG2亚型。第一方面，本专利技术提供了一种抗卡痛单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：步骤1：帽柱木碱完全抗原的制备：以帽柱木碱为原料，先用三氟乙酸酐保护仲胺基，再用氢氧化锂水解甲酯得到羧基，在羧基位点引入5-氨基戊酸增加臂长，得到帽柱木碱半抗原，通过碳二亚胺法使帽柱木碱半抗原偶联载体蛋白后，脱去保护基，得到帽柱木碱完全抗原。现有的卡痛全抗原活性较低。例如专利CN108732345A公开了一种检测人唾液中帽柱木碱及其衍生物和代谢物的检测试纸及制备方法，该帽柱木碱通过在苯环上引入丁二酸酐形成帽柱木碱半琥珀酸酯衍生物，使其能与牛血清蛋白偶联制成全抗原。但是本专利技术团队通过研究发现，帽柱木碱中仲胺基是抗原的重要活性基团，在上述方法中仲胺基未得到保护，引入丁二酸酐时会出现两个位点，偶联位点不明，导致其活性较低。此外，引入的支链(该支链用于偶联载体蛋白)臂长过短，容易导致大分子载体蛋白覆盖活性位点而无法保留卡痛分子中的活性基团，故获得的全抗原存在抗原活性低、特异性差、灵敏度低的问题。采用本专利技术的方法制备帽柱木碱完全抗原和7羟基帽柱木碱完全抗原，一方面能比较完整地保留的分子结构以及帽柱木碱抗原活性基团胺基和7羟基帽柱木碱抗原的活性基团羟基，另一方面通过增加支链长度以避免偶联载体蛋白后活性位点被覆盖(支链的长度需要在4-6个碳原子的直链最佳，过长会增加抗原决定簇，过短可能会覆盖小分子的抗原决定簇)，使获得的抗原具有较强的特异性和较高的灵敏度。此外，本专利技术的方法工艺步骤简单，反应收率较高，反应条件温和，且不需要使用毒性和腐蚀性较强的试剂。步骤2：7羟基帽柱木碱完全抗原的制备：以7羟基帽柱木碱为原料，用氢氧化锂水解甲酯得到羧基，在羧基位点引入5-氨基戊酸增加臂长，得到7羟基帽柱木碱半抗原，通过碳二亚胺法使7羟基帽柱木碱半抗原偶联载体蛋白后，得到7羟基帽柱木碱完全抗原。步骤3：杂交瘤细胞株的制备：用帽柱木碱完全抗原和7羟基帽柱木碱完全抗原共同免疫小鼠，得到杂交瘤细胞株Kratom11B7。采用“连续增强刺激法”免疫方法，具有抗原用量少、免疫时间短、稳定性好、亲和力强等优点。步骤4：抗体的制备：用杂交瘤细胞株Kratom11B7分泌产生抗卡痛单克隆抗体，分离、纯化处理。作为优选，步骤3包括：步骤3.1：免疫；步骤3.2：脾细胞与骨髓瘤细胞的融合；步骤3.3：杂交瘤细胞的筛选。进一步地，步骤3.1具体为：将帽柱木碱完全抗原和7羟基帽柱木碱完全抗原按质量比(0.8-1.2)∶1混合，然后用PBS缓冲液稀释浓度为0.8-1.2mg/ml；第1天免疫再将稀释后的抗原和完全佐剂按质量比(0.8-1.2)∶1混合，在小鼠皮下注射3-7ug/只，第6天用不完全佐剂混合抗原，在小鼠淋巴结附近注射8-12ug/只，第11天在小鼠淋巴结附近注射13-17ug/只，第16天在小鼠淋巴结附近注射18-22ug/只，第21天在小鼠淋巴结附近注射23-27ug/只，第24天在小鼠静脉直接注射3-7ug/只。进一步地，步骤3.2具体为：步骤3.2.1：饲养细胞悬液制备：小鼠摘眼球放血处死，浸泡于酒精中消毒，撕开小鼠腹外皮肤，暴露其腹膜，注入35-40℃预热的DMEM无血清培养基，轻揉小鼠腹腔1-2分钟，悬浮腹腔细胞，吸出腹腔液；剪开小鼠胸腔取胸腺研磨后收集悬液，与腹腔液合并离心，沉淀物用HAT完全培养液重悬，得到饲养细胞悬液；步骤3.2.2：小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：把小鼠骨髓瘤细胞SP2/0用含体积分数为8-12％FBS的DMEM培养基进行传代培养，细胞融合前一天进行传代以保证小鼠骨髓瘤细胞SP2/0适合生长对数期，生长状态良好用于细胞融合；步骤3.2.3：脾细胞制备：将上述免疫的小鼠处死，泡酒精中消毒后剖腹，无菌取出脾脏，将脾脏放在连接着离心管的滤网上，立即加入无血清的DMEM培养液，用眼科剪剪碎脾脏，然后用无菌注射器柄轻磨脾脏，使脾脏细胞经过网孔滤入离心管内，加无血清培养液，离心；弃上清用无血清培养液重复离心，待用；步骤3.2.4：脾细胞与骨髓瘤细胞融合：将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合均匀，离心洗涤细胞，去除上清液，置于35-40℃水浴，加入0.5-1.0ml35-40℃预温的PEG4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗卡痛单克隆抗体，其特征在于：由杂交瘤细胞株分泌而得，所述杂交瘤细胞株命名为Kratom11B7，已于2021年1月31日保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏号为CCTCCNO：C202146。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗卡痛单克隆抗体，其特征在于：由杂交瘤细胞株分泌而得，所述杂交瘤细胞株命名为Kratom11B7，已于2021年1月31日保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏号为CCTCCNO：C202146。


2.如权利要求1所述的抗卡痛单克隆抗体，其特征在于：所述抗卡痛单克隆抗体属于IgG2亚型。


3.一种如权利要求1或2所述抗卡痛单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1：帽柱木碱完全抗原的制备：以帽柱木碱为原料，先用三氟乙酸酐保护仲胺基，再用氢氧化锂水解甲酯得到羧基，在羧基位点引入5-氨基戊酸增加臂长，得到帽柱木碱半抗原，通过碳二亚胺法使帽柱木碱半抗原偶联载体蛋白后，脱去保护基，得到帽柱木碱完全抗原；
步骤2：7羟基帽柱木碱完全抗原的制备：以7羟基帽柱木碱为原料，用氢氧化锂水解甲酯得到羧基，在羧基位点引入5-氨基戊酸增加臂长，得到7羟基帽柱木碱半抗原，通过碳二亚胺法使7羟基帽柱木碱半抗原偶联载体蛋白后，得到7羟基帽柱木碱完全抗原；
步骤3：杂交瘤细胞株的制备：用帽柱木碱完全抗原和7羟基帽柱木碱完全抗原共同免疫小鼠，得到杂交瘤细胞株Kratom11B7；
步骤4：抗体的制备：用杂交瘤细胞株Kratom11B7分泌产生抗卡痛单克隆抗体，分离、纯化处理。


4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤3包括：
步骤3.1：免疫；
步骤3.2：脾细胞与骨髓瘤细胞的融合；
步骤3.3：杂交瘤细胞的筛选。


5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤1中，所述帽柱木碱完全抗原的制备包括：
a)保护氨基：将帽柱木碱溶于有机溶剂中，室温搅拌溶解，在冰水浴、惰性气体保护下，缓慢滴加帽柱木碱摩尔量1-3倍的三氟乙酸酐，撤去冰水浴，室温搅拌反应；反应结束后，在水浴下减压蒸干溶剂，得淡黄色油液体，加入正己烷溶解，在冰水浴中结晶成白色固体，用正己烷洗涤白色固体；
b)水解酯基：向所得白色固体中加入甲醇和水，再加入其5-10倍摩尔量的氢氧化锂，搅拌溶解后继续反应；反应结束，用薄板层析分析，原料Rf=0.6-0.8，产物Rf=0.2-0.4，用稀盐酸调pH=4.5-5.5，在水浴下减压蒸干溶剂；加入无水乙醇溶解，过滤，将溶剂减压蒸干；用薄板层析法分离，以石油醚/甲醇混合溶液作为展开剂，紫外下收集Rf=0.2-0.4的产物点，收集所得硅胶用无水乙醇反复提取，混合后，减压蒸去无水乙醇，得到淡黄色油状物帽柱木碱酸；
c)增加臂长引入羧基：将所得帽柱木碱酸溶于吡啶，加入其1-3倍摩尔量的5-氨基戊酸，再加入与5-氨基戊酸等摩尔量的EDC室温搅拌；反应结束后，减压蒸去溶剂，加二氯甲烷溶解，萃取多次，取下层有机相，有机相干燥，过滤，减压蒸去溶剂；用薄板层析法分离，以95wt%乙醇/氨水/二氯甲烷/1，4-二氧六环混合溶液作为展开剂，紫外下收集Rf=0.4-0.5的产物点，收集所得硅胶用无水乙醇反复提取，混合后，减压蒸去无水乙醇，得到油状物，即帽柱木碱半抗原；
d)活化偶联载体蛋白：将所得帽柱木碱半抗原溶于二甲基甲酰胺中，加入帽柱木碱半抗原0.4-0.5倍质量的N-羟基琥珀酰亚胺和帽柱木碱半抗原0.7-0.8倍质量的二环己基碳二亚胺，室温下搅拌过夜，离心，取上清；以1:3-5的体积比将上清加入至8-12mg/ml的载体蛋白/PBS溶液中，混合均匀，室温搅拌反应后，静置过夜；将反应液置入pH为11-13的碳酸钠溶液中进行透析，再用PBS缓冲液中进行透析，期间每天换缓冲液；透析结束后，将反应液离心，取上层清液即为帽柱木碱完全抗原。


6.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑智彪，郑曙剑，
申请(专利权)人：杭州隆基生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33