一种抗苦荞金属硫蛋白FtMT单克隆抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属单克隆抗体制备技术领域，提供一种抗苦荞金属硫蛋白FtMT单克隆抗体及其制备方法和应用。该抗体通过含多羟基化合物和非离液序列盐洗脱实现与抗原FtMT解离的抗苦荞金属硫蛋白单克隆抗体，即抗FtMT PR‑mAb。可以在多羟基化合物如乙二醇、丙二醇及丁二醇和非离液序列盐如硫酸铵、氯化钠等的存在下，在非强酸性、非高盐的温和条件实现与抗原FtMT的解离。作为一种良好的免疫亲和配基应用于FtMT免疫亲和层析中，即可以保证目的蛋白特征和活性，又可减少对单抗的破坏、延长免疫亲和柱的寿命，更重要的是保证了纯化过程中FtMT的MT/金属离子复合物存在形式，实现了具有天然结构和功能的非融合MT的高效分离纯化。

【技术实现步骤摘要】
一种抗苦荞金属硫蛋白FtMT单克隆抗体及其制备方法和应用
本专利技术属于单克隆抗体制备
，具体涉及一种抗苦荞金属硫蛋白FtMT单克隆抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
MT（Metallothionein，MT）是一类广泛存在于生物界，分子量较低(6~7kDa)，富含半胱氨酸，缺少芳香族氨基酸和组氨酸，且能与多种重金属结合的热稳定胞内蛋白质。研究证实多数物种内存在1个以上具有不同氨基酸组成和特性的MT亚型（isoform）。MT蛋白存在的广泛性、多态性，高度诱导性以及保守性，暗示其在生物体内具有极其重要的生理功能。现有研究结果已证实，MT在生物体体内主要负责解除重金属毒性；参与体内必需金属元素平衡；清除自由基、拮抗电离辐射；参与激素和发育过程调节，增强机体对各种应激的反应；抑制细胞凋亡，在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用，还与细胞的增殖、分化和凋亡密切相关。然而迄今关于不同来源的MT8营业款或MT亚型在体内生理进程中执行何种特定的生物学功能还尚未阐明。作为一种可以特异性结合金属离子的功能蛋白质，MT的金属结合能力特性是其发挥诸多生物学功能的基础；不同来源的MT或者MT亚型具有特定的金属结合特性或偏好，是其执行体内特定生理功能的决定因素。规模化制备具有天然结构和功能的MT，是其功能研究和应用开发的前提。由于活性巯基含量较高，极易被氧化，导致MT的分离纯化非常困难。近年来随着基因重组技术的发展，多种来源的MT蛋白实现了重组表达，为MT的研究和利用提供了可能。然而，MT必须与GST、MBP、SUMO等促溶标签融合以防止胞内降解和包涵体形成，或者与外膜蛋白LamB、OmpA或跨膜蛋白PAL融合表达至细胞外膜来降低胞内毒性和提高可溶性，才可实现重组表达。这两种重组表达策略都需要融合较大的外源基因片段而实现，需要复杂的蛋白酶切处理才能获得非融合MT蛋白，容易对MT的功能及结构产生较大影响。具有天然金属结合特性的非融合MT重组蛋白的重组表达，由于半衰期短、具有细胞毒性和易于形成包涵体等问题而难以实现。专利ZL201310430331.4以含有phoA启动子及可分泌至细胞周质的信号肽序列的phoA质粒作为表达载体，建立了一种可溶性重组华溪蟹金属硫蛋白（rcMT）的制备方法，较好的解决了小分子MT蛋白可溶性表达的技术问题，但仍然需要融合6His标签来达到快速纯化的目的。然而，即便是6His的小肽纯化标签，也会对MT的金属结合特性产生较大的影响（Tarasava,K.,Johannsen,S.,Freisinger,E.Solutionstructureofthecircularγ-domainanalogfromthewheatmetallothioneinE(c)-1.Molecules,2013,18(11):14414-14429）。无任何纯化标签的非融合MT，必须通过丙酮梯度粗提、琼脂糖凝胶分离及离子交换层析一系列复杂的操作实现分离纯化。过于繁杂的操作不仅耗时费力，同时在操作过程中MT易被氧化而破坏（Pérez-Rafael,S,Mezger,A,Lieb,B,etal.ThemetalbindingabilitiesofMegathuracrenulatametallothionein(McMT)intheframeofGastropodaMTs.JInorgBiochem,2012,108:84-90）。利用单克隆抗体建立重组MT的免疫亲和纯化方法，不失为一个分离纯化非融合MT蛋白的最佳选择。然而免疫亲和层析纯化方法，多采用强酸和高盐条件来实现抗原抗体分离，纯化过程中容易影响MT/金属离子复合物的存在形式，影响其金属结合特性分析。苦荞(Tartarybuckwheat)属于寥科(polygonaceae)，荞麦属(FagopyrumMill)，是一种起源于我国而广泛分布种植于东北亚、东欧等高寒地区的粮食和经济作物。作为一种抗逆性表现良好的“食药同源”作物，苦荞金属硫蛋白（FtMT）在保健、药用和化妆品等领域具有广阔的应用前景。而具有天然结构和功能的非融合FtMT规模化制备问题，现有技术因上述原因尚无法解决。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种抗苦荞金属硫蛋白FtMT单克隆抗体，该抗体可以在多羟基化合物（polyhydroxylatedcompound，简称polyol）如乙二醇、丙二醇及丁二醇和非离液序列盐（nonchaotropicsalt）如硫酸铵、氯化钠等的存在下，在非强酸性、非高盐的温和条件实现与抗原FtMT的解离，具有所谓的“polyol-responsive”特性，称为抗FtMTPR-mAb。本专利技术的另一目的在于提供该抗苦荞金属硫蛋白（FtMT）单克隆抗体在FtMT免疫亲和层析中的应用。该抗体作为一种良好的免疫亲和配基应用于FtMT免疫亲和层析中，即可以保证目的蛋白特征和活性，又可减少对单抗的破坏、延长免疫亲和柱的寿命，更重要的是保证了纯化过程中FtMT的MT/金属离子复合物存在形式，实现了具有天然结构和功能的非融合MT的高效分离纯化。本专利技术由如下技术方案实现的：一种抗苦荞金属硫蛋白FtMT单克隆抗体抗FtMTPR-mAb的制备方法，包括以下步骤：（1）制备抗原：将苦荞金属硫蛋白FtMT编码区基因Accession:KY643823.1亚克隆至phoA表达质粒，利用质粒的phoA启动子和分泌信号序列，在低磷培养基诱导下分泌至周质，表达可溶性FtMT-6His融合蛋白，用镍柱亲和层析纯化获得FtMT-6His融合蛋白；（2）动物免疫：以重组FtMT-6His作为免疫蛋白，与QuickAntibody-Mouse5W水溶性免疫佐剂1:1快速混合后，按免疫剂量25μg/100μL，于小鼠小腿肌肉注射，免疫5~6周龄雌性BALB/c小鼠；3周后按同样方式加强免疫1针；5周后，采尾血进行间接ELISA检测；当血清滴度达到1:104~1:107范围内，腹腔注射冲击免疫25μg/500μL；（3）细胞融合：选取鼠脾细胞，与骨髓瘤细胞利用PEG1500试剂进行体外融合，以FtMT-6His作为包被抗原，利用间接非竞争ELISA法筛选分泌抗FtMT的杂交瘤细胞株；同时用含His-tag的重组IGF蛋白作无关抗原做交叉筛选，排除针对His-tag表位的假阳性；按抗体亚类鉴定试剂盒操作说明进行亚类鉴定；（4）mAb腹水制备及鉴定：以液体石蜡作为致敏剂，采用体内诱生法制备腹水，利用疏水电荷层析HCIC和ProteinA亲和层析相结合的方法纯化腹水；纯化的样品经12%SDS-PAGE和Westernblot法鉴定分析；（5）ELISA-elution筛选：以FtMT-6His蛋白作为筛选抗原，采用“ELISA-elution”方法筛选抗FtMTPR-mAb：96孔酶标板，pH9.6碳酸盐缓冲液包被FtMT-6His，10μg/ml，100μl/孔，4℃保存过夜经PBSB洗板后加明胶封闭；加入抗体样品100μl/孔，37℃孵育1.5h，PBSB本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗苦荞金属硫蛋白FtMT单克隆抗体抗FtMT PR-mAb的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：/n（1）制备抗原：将苦荞金属硫蛋白FtMT编码区基因Accession:KY643823.1亚克隆至phoA表达质粒，利用质粒的phoA启动子和分泌信号序列，在低磷培养基诱导下分泌至周质，表达可溶性FtMT-6His融合蛋白，用镍柱亲和层析纯化获得FtMT-6His融合蛋白；/n（2）动物免疫：以重组FtMT-6His作为免疫蛋白，与Quick Antibody-Mouse5W水溶性免疫佐剂1:1快速混合后，按免疫剂量25 μg/100 μL，于小鼠小腿肌肉注射，免疫5~6周龄雌性BALB/c小鼠； 3周后按同样方式加强免疫1针；5周后，采尾血进行间接ELISA检测；当血清滴度达到1:10

【技术特征摘要】
1.一种抗苦荞金属硫蛋白FtMT单克隆抗体抗FtMTPR-mAb的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）制备抗原：将苦荞金属硫蛋白FtMT编码区基因Accession:KY643823.1亚克隆至phoA表达质粒，利用质粒的phoA启动子和分泌信号序列，在低磷培养基诱导下分泌至周质，表达可溶性FtMT-6His融合蛋白，用镍柱亲和层析纯化获得FtMT-6His融合蛋白；
（2）动物免疫：以重组FtMT-6His作为免疫蛋白，与QuickAntibody-Mouse5W水溶性免疫佐剂1:1快速混合后，按免疫剂量25μg/100μL，于小鼠小腿肌肉注射，免疫5~6周龄雌性BALB/c小鼠；3周后按同样方式加强免疫1针；5周后，采尾血进行间接ELISA检测；当血清滴度达到1:104~1:107范围内，腹腔注射冲击免疫25μg/500μL；
（3）细胞融合：选取鼠脾细胞，与骨髓瘤细胞利用PEG1500试剂进行体外融合，以FtMT-6His作为包被抗原，利用间接非竞争ELISA法筛选分泌抗FtMT的杂交瘤细胞株；同时用含His-tag的重组IGF蛋白作无关抗原做交叉筛选，排除针对His-tag表位的假阳性；按抗体亚类鉴定试剂盒操作说明进行亚类鉴定；
（4）mAb腹水制备及鉴定：以液体石蜡作为致敏剂，采用体内诱生法制备腹水，利用疏水电荷层析HCIC和ProteinA亲和层析相结合的方法纯化腹水；纯化的样品经12%SDS-PAGE和Westernblot法鉴定分析；
（5）ELISA-elution筛选：以FtMT-6His蛋白作为筛选抗原，采用“ELISA-elution”方法筛选抗FtMTPR-mAb：96孔酶标板，pH9.6碳酸盐缓冲液包被FtMT-6His，10μg/ml，100μl/孔，4℃保存过夜经PBSB洗板后加明胶封闭；加入抗体样品100μl/孔，37℃孵育1.5h，PBSB洗板后加入polyol洗脱液或对照洗脱液室温孵育20min；PBST洗板甩干后，加入1:5000稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP为二抗，以邻苯二胺OPD溶液为反应底物，2MH2SO430μl/孔终止反应后，492nm处酶标仪测定；经polyol洗脱液洗脱后，其信号降低50%以上，即为目的抗FtMTPR-mAb。


2.根据权利要求1所述的一种抗苦荞金属硫蛋白FtMT单克隆抗体抗FtMTPR-mAb的制备方法，其特征在于：步骤（5）中所述polyol洗脱液为：40%丙二醇+0.75M(NH4)2SO4，50mMTris-HCl，pH7.9；所述对照洗脱液为50mMTris-HCl，pH7.9。


3.一种抗苦荞金属硫蛋白FtMT单克隆抗体抗FtMTPR-mAb在FtMT免疫亲和层析中的应用，其特征在于：步骤如下：
（1）FtMT免疫亲和柱制备：获得的抗FtMTPR-mAb经超滤交换交换至偶联缓冲液中，经1mM、pH4.0的HCl多次洗涤，再重悬于偶联缓冲液中；按15mgFtMT单抗：1g干重的活化基质的比例混合后封闭，摇床振荡孵育偶联缓冲液清洗多余未偶联的mAb，最后用封闭缓冲液I孵育以封闭未偶联活化位点；依次用封闭缓冲液II和醋酸缓冲液交替洗涤基质；重悬于0.01MPBS、pH7.4的缓冲液中，加入0.05%NaN3，4℃保存待用；
（2）非融合FtMT表达：参考FtMT-6His制备方法表达非融合FtMT蛋白；其中，利用PCR引物FtMT-F：5'-GCCATGGCCTCTTGCTGCGGT...

【专利技术属性】
技术研发人员：何永吉，李云龙，卢晓霞，李红梅，胡俊君，程哲，郭洪，李琪，
申请(专利权)人：山西省农业科学院农产品加工研究所，
类型：发明
国别省市：山西;14