一株抗猪δ冠状病毒N蛋白抗原表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体和应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及杂交瘤细胞株及其分泌的抗体，特别是指一株抗猪δ冠状病毒（PDCoV）N蛋白抗原表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体和应用。所述抗原表位的氨基酸序列为326

【技术实现步骤摘要】
一株抗猪
δ
冠状病毒N蛋白抗原表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体和应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及杂交瘤细胞株及其分泌的抗体，特别是指一株抗猪δ冠状病毒N蛋白抗原表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体和应用。

技术介绍

[0002]猪δ冠状病毒(PDCoV)属于冠状病毒科δ冠状病毒属成员，是近年来新出现的一种肠道冠状病毒，能够引起哺乳仔猪急性腹泻，呕吐，脱水，肠道绒毛萎缩，甚至导致死亡，严重影响猪的生长，对养猪业造成严重危害。DCoV引起仔猪的死亡率高达30％
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50％，目前尚无有效的疫苗或治疗药物。2012年PDCoV由Woo等人最先鉴定、报道，随后PDCoV快速蔓延至多个国家，具有全球流行的潜在趋势，引起世界各国的极大关注。2014年我国相继从多个省份的病料中检测到了PDCoV的感染。
[0003]PDCoV病毒是单股正链RNA病毒，基因组全长25.4kb，是目前已知的最小冠状病毒。PDCoV的基因组包括：5
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端非翻译区、ORF、ORF1a、ORF1b、棘突(S)蛋白、N蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白、辅助蛋白NS6、辅助蛋白NS7、NS7a和3
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端非翻译区等。PDCoV感染的靶器官是猪小肠，尤其是空肠和回肠，肠壁变薄、充满黄色液体。组织学观察发现肠绒毛萎缩、脱落，肠上皮细胞大量死亡且严重空泡化，固有层有大量炎性细胞浸润。PDCoV感染的临床症状与PEDV和TGEV引起的临床症状难以区分。本实验室之前的报道显示，在腹泻猪中，PDCoV和PEDV的混合感染率高达60.4％；但在收集的临床样品中，TGEV与PDCoV混合感染的比例相对较低，约为5.94％。目前没有针对PDCoV的商业疫苗。为了控制PDCoV的传播，有效地进行抗病毒治疗，需要一种快速、准确的诊断方法在疾病早期发现PDCoV的感染。
[0004]目前实验室检测是诊断PDCoV感染的主要手段。检测方法可分为抗原检测和抗体检测。目前，其中病原学检测有常规逆转录
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聚合酶链反应(RT
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PCR)、实时RT
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PCR、巢式RT
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PCR以及高通量测序。这些方法在检测病毒遗传物质方面具有较高的灵敏度和可靠性，但都需要依靠昂贵的仪器，成本较高。血清学检测方法主要有有间接ELISA法、FMIA、免疫组化、免疫荧光以及病毒中和试验等。虽然这些方法都可以检测血清抗体，但ELISA方法更方便和快速。间接ELISA方法容易受到血清中补体或各种细胞因子的影响，从而增加非特异性结合，影响检测结果。
[0005]PDCoV N蛋白是PDCoV中最保守和丰富的结构蛋白之一，在细胞中大量表达，病毒感染后引起早期免疫，具有作为PDCoV诊断靶点的潜力。目前针对PDCoV N蛋白抗体检测的ELISA方法均为间接法，而目前研究发现不同冠状病毒的N蛋白之间存在一定的交叉，其血清可能会与其他冠状病毒存在交叉反应，为解决现有PDCoV N蛋白抗体检测中的问题，迫切需要建立一个基于N蛋白抗原表位及其配对单克隆抗体的检测方法确，以实现快速的检测PDCoV。

技术实现思路

[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提出一株抗猪δ冠状病毒N蛋白抗原表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体和应用。
[0007]本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0008]一株抗猪δ冠状病毒N蛋白抗原表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述抗原表位的氨基酸序列为
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QDWEWDDA
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，杂交瘤细胞株的分类命名为：杂交瘤细胞株PDCoV
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N
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6B7，保藏编号：CCTCC NO：C202178，保藏日：2021.3.26，保藏地址：中国，武汉，武汉大学。
[0009]所述单克隆抗体命名为单抗6B7。
[0010]基于N蛋白抗原表位和权利要求2所述的单克隆抗体的PDCoV阻断ELISA抗体检测试剂盒，包括抗原包被板、样本稀释液PBST 20mL、25
×
浓缩洗涤液PBST 20mL、阴阳对照血清、酶标抗体、TMB单组分显色液25mL和ELISA终止液15mL。
[0011]所述抗原包被板包括N蛋白、0.2M PB磷酸盐缓冲液和封闭液，其中酶标抗体为单抗6B7经过过碘酸钠法标记得到。
[0012]上述的PDCoV阻断ELISA抗体检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤为：
[0013](1)包被：以0.2M PB磷酸盐缓冲液为包被液稀释N蛋白，加入酶标板中，每孔100μL，于37℃中放置3小时，弃去包被液，后经PBST洗涤2次，拍干；
[0014](2)封闭：每孔加入150μL 1％BSA+5％蔗糖+0.01M PBS的封闭液，于37℃中放置2小时。弃去封闭液，拍干后37℃烘干，放入含有干燥剂的自封袋中密封；
[0015](3)样品：分别加入使用0.01M PBST按照1/8倍稀释的阴阳性血清和临床样品，每孔50μL，贴上封板贴，于37℃温箱中反应30分钟；
[0016](4)酶标抗体：加入使用抗体保护剂稀释的酶标单抗，每孔50μL，轻微振板混匀，贴上封板贴，于37℃温箱中反应30分钟；
[0017](5)显色：经洗板4次拍干后，加入底物索莱宝TMB单组分显色液进行显色，每孔100μL，贴上封板贴，于37℃温箱中避光反应10分钟；
[0018](6)终止：加入索莱宝ELISA终止液终止显色反应，每孔50μL，轻微振板混匀，使用酶标仪读值；
[0019](7)结果判定：根据各孔的值计算其S/N值，其中S为样品的值，N为阴性对照的值，阴阳性对照各做一组重复，N取其平均值；S/N值≤0.559判定为阳性，S/N值≥0.804判定为阴性，0.559<S/N值<0.804判定为可疑，可疑样品进行复检，复检结果S/N值>0.804判定为阴性，S/N值≤0.804判定为阳性。
[0020]所述步骤(1)中N蛋白的包被浓度为1μg/ml。
[0021]所述步骤(4)中酶标单抗被抗体保护剂稀释的倍数为2000倍。
[0022]所述步骤(6)中酶标仪读值时是在OD450nm。
[0023]本专利技术具有以下有益效果：
[0024]1、本申请专利技术人对N蛋白的抗原表位优势区进行分时，发现N蛋白大部分区域都有较好的亲水性，大部分区域都具有较好的抗原性，根据抗原表位区域分布情况设计出5对交叉重叠的N基因短截引物，对五段截短N蛋白分别设计引物。根据设计的引物表达出5个交叉重叠且包含全长的N短截蛋白，使用WB方法鉴定发现，单抗6B7与N
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5短截蛋白反应，为进一步鉴定单抗6B7的识别区域，本申请将N
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5蛋白分段为两部分交叉的蛋白设计引物，构建重
组质粒，进行表达并进行本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株抗猪δ冠状病毒N蛋白抗原表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述抗原表位的氨基酸序列为
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QDWEWDDA
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，杂交瘤细胞株的分类命名为：杂交瘤细胞株PDCoV
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N
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6B7，保藏编号：CCTCC NO：C202178，保藏日：2021.3.26，保藏地址：中国，武汉，武汉大学。2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体命名为单抗6B7。3.基于N蛋白抗原表位和权利要求2所述的单克隆抗体的PDCoV阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：抗原包被板、样本稀释液PBST 20mL、25
×
浓缩洗涤液PBST 20mL、阴阳对照血清、酶标抗体、TMB单组分显色液25mL和ELISA终止液15mL。4.根据权利要求3所述的PDCoV阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述抗原包被板包括N蛋白、0.2M PB磷酸盐缓冲液和封闭液，其中酶标抗体为单抗6B7经过过碘酸钠法标记得到。5.权利要求3或4所述的PDCoV阻断ELISA抗体检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤为：（1）包被：以 0.2M PB磷酸盐缓冲液为包被液稀释N蛋白，加入酶标板中，每孔100μL，于37℃中放置3小时，弃去包被液，后经PBST洗涤2次，拍干；（2）封闭：每孔加入150...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡慧，魏战勇，任豪杰，郑兰兰，张红垒，靳晓慧，祖少坡，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：