具有广谱性中和猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株具有广谱性中和猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体及其应用。所述的单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No.13840的杂交瘤细胞分泌产生。所述的单克隆抗体具有广谱性，能够有效中和PEDV

【技术实现步骤摘要】
具有广谱性中和猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及一种单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。特别涉及一种具有广谱性中和猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。本专利技术属于生物


技术介绍

[0002]猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)是养猪业中引发仔猪腹泻、消瘦、脱水的重要病原体之一，给养猪业带来重大经济损失。研究表明，PEDV有两个基因亚型，即G1和G2亚型。2010年之前，PEDV流行毒株以G1亚型为主，2010年之后，PEDV流行毒株以G2亚型为主。基因序列分析表明，PEDV G1和G2亚型的主要差异在S基因上。G1亚型毒株S基因由4152nt构成，编码1383个氨基酸，而G2的S基因为4161nt构成，编码1386个氨基酸，在基因长度上增加了9个碱基。基因内部也存在较大差异。PEDV基因组中最大的变异位于S基因，而S基因中的突变主要集中在N末端。NPL
‑
PEDV/2013/P10与NPL
‑
PEDV/2013相比，ORF1a/b蛋白、核蛋白、NS3B、膜蛋白以及囊膜蛋白在氨基酸水平上完全一致。而在纤突蛋白(S)中含有六个核苷酸多态性，导致氨基酸位点变化：F375L、T486P、D856E、A1081V、A1099S以及Y1253D。在S1区域有2个氨基酸变异，在S2区域有4个氨基酸变异(Lawrence et al.,2014)。冠状病毒S蛋白能够诱导中和性抗体的产生，S基因变异必然会导致S蛋白诱导产生的中和性抗体在中和病毒方面上存在差异。
[0003]因此，获得一株具有广谱性中和猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体，对于猪流行性腹泻病毒的防治具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在提供一种具有广谱性中和猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体、分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：
[0006]本专利技术以纯化的猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株LNCT2的病毒粒子为抗原，免疫BALB/c小鼠，获得1株稳定分泌抗PEDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为5F7。经鉴定，该杂交瘤细胞培养上清和腹水抗体效价分别为1：1000和1:100000。5F7单抗亚类为IgG2a，轻链为κ型。IFA(间接免疫荧光检测)检测发现，5F7单抗与病毒发生反应；Westernblot结果显示，5F7单抗与PEDV粒子、S蛋白均发生反应；上述两种结果表明该单抗的抗原表位为线性表位，抗原表位位于S蛋白的1261aa～1386aa之间。PEDV S蛋白根据结构和功能可分为S1和S2两个区域，其中S1区域含有病毒入侵细胞的受体结合区域，该区域也是诱导机体产生中和性抗体的关键区域；S2区域的主要功能为介导病毒与细胞发生膜融合。经抗原表位鉴定发现，5F7抗体的抗原表位位于S2区域。该抗体是首个针对PEDV S2区域的中和性抗体，具有广谱性。病毒中和实验也表明，该单抗能够有效中和PEDV
‑
LNCT2、PEDV
‑
LNSY和PEDV
‑
Hjms等G2基因亚型毒株，使其失去感染细胞的能力，也能够中和CV777毒株(G1基因亚型)。鉴于该
单抗的生物学特性，该单抗具有广谱性中和PEDV毒株的能力，该抗体可用于建立一系列阻断ELISA、捕获ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和胶体金试纸条等诊断方法，具备广阔的应用价值和研究价值。
[0007]本专利技术的一株稳定分泌抗猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为5F7，分类命名为小鼠抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体细胞株，所述的杂交瘤细胞株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13840，保藏时间是2017年4月24日。
[0008]进一步的，本专利技术还提出了一株具有广谱性中和猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体，其是由本专利技术以上所述的杂交瘤细胞株分泌产生。
[0009]更进一步的，本专利技术还提出了所述的单克隆抗体在制备检测猪流行性腹泻病毒试剂中的应用。
[0010]其中，优选的，所述的猪流行性腹泻病毒包括G1和G2亚型的猪流行性腹泻病毒。
[0011]其中，优选的，所述的试剂包括用于阻断ELISA、捕获ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和胶体金试纸条检测猪流行性腹泻病毒的试剂。
[0012]相较于现有技术，本专利技术的有益效果是：
[0013]本专利技术首次提出了一种针对PEDV S2区域的中和性单克隆抗体，该单克隆抗体具有广谱性，能够有效中和PEDV
‑
LNCT2、PEDV
‑
LNSY和PEDV
‑
Hjms等G2基因亚型毒株，使其失去感染细胞的能力，也能够中和CV777毒株(G1基因亚型)。鉴于该单克隆抗体的生物学特性以及所具有的广谱性中和PEDV毒株的能力，该单克隆抗体可用于建立一系列包括阻断ELISA、捕获ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和胶体金试纸条等方法在内的PEDV诊断方法，具备广阔的应用价值和研究价值。
附图说明
[0014]图1为5F7抗体抗原表位鉴定示意图；
[0015]图2为电镜观察PEDV病毒粒子；
[0016]图3为IFA检测5F7单抗与PEDV反应；
[0017]其中，LNCT2为5F7单抗与接种LNCT2毒株的细胞发生反应；CV777为5F7单抗与接种CV777毒株的细胞发生反应；E6为5F7单抗与健康细胞反应结果，图中的标尺为400nm；
[0018]图4为Western
‑
blot验证5F7单抗与PEDV蛋白组分的反应情况；
[0019]其中，1：PEDV
‑
LNCT2 S蛋白；2：PEDV
‑
LNCT2；3：PEDV
‑
CV777；4：Vero
‑
E6细胞；
[0020]图5为5F7单抗与病毒中和实验测定；
[0021]图6为单抗的抗原表位鉴定；
[0022]其中，1图为转染表达S蛋白中第1261aa至1386aa的真核表达质粒转染的细胞与5F7单抗的反应结果；2图为健康Vero E6细胞与5F7单抗的反应结果，图中的标尺为200nm。
具体实施方式
[0023]下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而
更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株稳定分泌抗猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为5F7，所述的杂交瘤细胞株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13840，保藏时间是2017年4月24日。2.具有广谱性中和猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体是由权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯力，刘建波，时洪艳，陈建飞，张鑫，石达，
申请(专利权)人：哈尔滨维科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：