一种病毒VP2蛋白分离纯化的规模化生产方法技术

一种病毒VP2蛋白分离纯化的规模化生产方法，属于生物制品技术领域。为解决利用大肠杆菌表达传染性法氏囊VP2蛋白生产鸡传染性法氏囊病疫苗会产生内毒素的问题，本发明专利技术提供了一种病毒VP2蛋白分离纯化的规模化生产方法，该方法为将大肠杆菌破碎后，加入一定比例的脱氧胆酸钠，然后加入有机磷酸盐缓冲液作为螯合剂，调节适当的pH，同时在溶液中加入一定浓度的NaCl，充分混匀后，利用中空纤维柱的切向流过滤功能，将内毒素单体去除。本发明专利技术所述生产方法既能生产出高浓度的法氏囊VP2蛋白，又能符合新版兽药GMP生产要求，具备低生产成本的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种病毒VP2蛋白分离纯化的规模化生产方法
本专利技术属于生物制品
，具体涉及的是一种病毒VP2蛋白分离纯化的规模化生产方法。
技术介绍
鸡传染性法氏囊病(InfectiousBursalDisease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(InfectiousBursalDiseasevirus,IBDV)引起的一种急性、高度传染性的免疫抑制性疾病。IBDV主要结构蛋白VP2含有血清型特异性、能诱导中和抗体产生的构象依赖型抗原决定簇,其诱导的中和抗体能被动地保护宿主不受IBDV的感染,是IBDV的主要保护性抗原,具有特异性,因而成为制备法氏囊病基因工程亚单位疫苗的主要蛋白。现有技术常利用能够表达传染性法氏囊病病毒的VP2基因的大肠杆菌生产VP2蛋白，进而生产鸡传染性法氏囊病疫苗。该方法获得法氏囊VP2蛋白需要先将大肠杆菌破碎，而大肠杆菌破碎不可避免的产生大量的内毒素，内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，叫做脂多糖。脂多糖对宿主是有毒性的。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以叫做内毒素。内毒素位于细胞壁的最外层、覆盖于细胞壁的黏肽上。各种细菌的内毒素的毒性作用较弱，大致相同，可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等。因此如果不将内毒素降低到一定范围，就会对接种疫苗的动物产生(严重)副反应。为了将大肠杆菌破碎产生的内毒素控制在一定的范围内，就需要对法氏囊VP2蛋白进行分离纯化。现在去除内毒素最常用也最有效的方式就是层析方法，但这种方法就是需要特殊的填料，而这种填料的成本也比较昂贵，已经超出禽用疫苗的生产成本范围。还有一种价格相对低廉的萃取方式，但这种方式需要反复的离心，离心过程中的一些操作方式有可能不符合新版的GMP规范要求。因禽用疫苗市场售价低廉，需控制生产成本，疫苗品质必须保证，既要对蛋白进行高浓度提纯，又要控制纯化过程中的成本，这就增加了后续分离纯化的难度。因此，急需一种既能高浓度提纯法氏囊VP2蛋白，又能降低生产成本的法氏囊VP2蛋白的分离纯化的规模化生产方法。
技术实现思路
本专利技术为解决利用大肠杆菌表达传染性法氏囊VP2蛋白生产鸡传染性法氏囊病疫苗会产生内毒素的问题，提供了一种符合生产成本要求和GMP规范的病毒VP2蛋白分离纯化的规模化生产方法，具体生产方法如下：步骤一、表达法氏囊病病毒的VP2基因的大肠杆菌菌体经裂解液重悬、高压匀质机破碎及离心后获得菌液；步骤二、将步骤一获得的菌液放入超滤孔径的中空纤维柱中，在封闭透出端后，进行反复冲刷，然后打开透出端，调整流速，将柱内体积浓缩至原体积的1/5-1/10后关闭透出端；步骤三、向柱内加入等体积的PB缓冲液，关闭透出端，柱内循环15min-30min，打开透出端，将菌液体积再次浓缩至加入缓冲液之前的体积，然后用PB缓冲液对菌液进行连续洗滤，直至透出端废液体积达到罐内液体体积的4-8倍；步骤四、向步骤三获得的菌液中加入等体积的含有脱氧胆酸钠和氯化钠的混合液，调节pH至7.0-7.5，关闭透出端阀门，柱内循环15min-30min，然后用含有脱氧胆酸钠和氯化钠的PB缓冲液对菌液进行连续洗滤，直至透出端废液体积达到罐内液体体积的5-10倍完成整个工艺流程。进一步地限定，步骤一所述裂解液为0.1mol/L-0.3mol/L的PB缓冲液，大肠杆菌菌体湿菌重与裂解液的体积比为1:10。进一步地限定，步骤一所述破碎的压力为800bar，重复3次。进一步地限定，步骤一所述离心为用碟片离心机离心，转速为10000r/min。进一步地限定，步骤三所述连续洗滤的方法为将PB缓冲液匀速加入罐内，打开透出端阀门，将透出端流速调节至与缓冲液注入速度相同，将进口端压力控制在6psi-12psi。进一步地限定，步骤四所述含有脱氧胆酸钠和氯化钠的混合液中，脱氧胆酸钠的质量分数为1％-2％，氯化钠的浓度为1M。进一步地限定，步骤四所述含有脱氧胆酸钠和氯化钠的PB缓冲液中，脱氧胆酸钠的质量分数为0.5％-1％，氯化钠的浓度为0.5M。进一步地限定，步骤四所述连续洗脱的方法为将含有脱氧胆酸钠和氯化钠的PB缓冲液匀速加入柱内，打开透出端阀门，将透出端流速调节至与缓冲液注入速度相同，将进口端压力控制在6psi-12psi。有益效果我们利用中空纤维纯化系统针对大肠杆菌表达的法氏囊VP2蛋白进行纯化，具体方法为将大肠杆菌破碎后，加入一定比例的脱氧胆酸钠，然后加入有机磷酸盐缓冲液作为螯合剂，调节适当的pH，可将内毒素聚集体解聚为单体，也可以打开内毒素-蛋白质复合物。同时在溶液中加入一定浓度的NaCl，充分混匀后，利用中空纤维柱的切向流过滤功能，将内毒素单体去除，而后选择适合孔径的膜柱，进行蛋白的沉淀，复溶，提纯等多个步骤。最终生产出高浓度的法氏囊VP2蛋白，从而满足疫苗生产要求。本专利技术所述生产方法具备以下优点：1、简化了生产过程，操作便捷，工序简单，用一台机器可以完成多项操作，满足各项生产指标的要求。2、将生产成本控制在禽用疫苗可接受的范围内。3、调整后的整个生产流程更加符合新版兽药GMP生产要求。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术并不限于以下实施例。实施例1步骤一、将表达法氏囊病病毒的VP2基因的大肠杆菌菌体按1:10(湿菌重：裂解液)的比例加入菌体裂解液(0.1mol/L-0.3mol/LPB缓冲液)，重悬，然后用高压匀质机进行菌体破碎，破碎压力为800bar，重复3次，破碎后的菌液再用碟片离心机离心，离心机的转速为10000r/min，离心后收集菌液，以去除菌体碎片。步骤二、用超滤孔径的中空纤维柱对破碎后的菌液进行浓缩处理，运行机器，将透出端封闭后，让菌液在中空纤维柱中反复冲刷，打开透出端，调整至合适流速(不同膜及膜面积流速不同)，当柱内体积浓缩至原体积的1/5-1/10体积后，关闭透出端，暂停机器。步骤三、向柱内加入等体积缓冲液(PB)，关闭透出端，柱内循环15-30min，让缓冲液与菌液充分混匀后，打开透出端，将溶液体积再次浓缩至加入缓冲液之前的体积，然后将缓冲液匀速加入罐内，打开透出端阀门，将透出端流速调节至与缓冲液注入速度相同，而后对菌液进行连续洗滤，将进口端压力控制在6psi-12psi，当透出端废液体积达到罐内液体体积的4-8倍时，将机器暂停。步骤四、向步骤三获得的菌液中加入等体积的含有脱氧胆酸钠和氯化钠的混合液，并调节pH值至7.0-7.5，关闭透出端阀门，运行机器，让菌液进行柱内循环，循环15min-30min后打开透出端，然后将含有脱氧胆酸钠和氯化钠的PB缓冲液匀速加入罐内，打开透出端阀门，将透出端流速调节至与缓冲液注入速度相同，而后对菌液进行连续洗滤，将进口端压力控制在6psi-12psi，当透出端废液体积达到罐内液体体积的5-10倍时，将机器暂停，将菌液收集到储存罐中，清洗机器，整个工艺流程完成。根据琼扩和内毒素检测，我们可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种病毒VP2蛋白分离纯化的规模化生产方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：/n步骤一、表达法氏囊病病毒的VP2基因的大肠杆菌菌体经裂解液重悬、高压匀质机破碎及离心后获得菌液；/n步骤二、将步骤一获得的菌液放入超滤孔径的中空纤维柱中，在封闭透出端后，进行反复冲刷，然后打开透出端，调整流速，将柱内体积浓缩至原体积的1/5-1/10后关闭透出端；/n步骤三、向柱内加入等体积的PB缓冲液，关闭透出端，柱内循环15min-30min，打开透出端，将菌液体积再次浓缩至加入缓冲液之前的体积，然后用PB缓冲液对菌液进行连续洗滤，直至透出端废液体积达到罐内液体体积的4-8倍；/n步骤四、向步骤三获得的菌液中加入等体积的含有脱氧胆酸钠和氯化钠的混合液，调节pH至7.0-7.5，关闭透出端阀门，柱内循环15min-30min，然后用含有脱氧胆酸钠和氯化钠的PB缓冲液对菌液进行连续洗滤，直至透出端废液体积达到罐内液体体积的5-10倍完成整个工艺流程。/n

【技术特征摘要】
1.一种病毒VP2蛋白分离纯化的规模化生产方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤一、表达法氏囊病病毒的VP2基因的大肠杆菌菌体经裂解液重悬、高压匀质机破碎及离心后获得菌液；
步骤二、将步骤一获得的菌液放入超滤孔径的中空纤维柱中，在封闭透出端后，进行反复冲刷，然后打开透出端，调整流速，将柱内体积浓缩至原体积的1/5-1/10后关闭透出端；
步骤三、向柱内加入等体积的PB缓冲液，关闭透出端，柱内循环15min-30min，打开透出端，将菌液体积再次浓缩至加入缓冲液之前的体积，然后用PB缓冲液对菌液进行连续洗滤，直至透出端废液体积达到罐内液体体积的4-8倍；
步骤四、向步骤三获得的菌液中加入等体积的含有脱氧胆酸钠和氯化钠的混合液，调节pH至7.0-7.5，关闭透出端阀门，柱内循环15min-30min，然后用含有脱氧胆酸钠和氯化钠的PB缓冲液对菌液进行连续洗滤，直至透出端废液体积达到罐内液体体积的5-10倍完成整个工艺流程。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一所述裂解液为0.1mol/L-0.3mol/L的PB缓冲液，大肠杆菌菌体湿菌重与裂解液的体积比为1:1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王青竹，鞠妍，高宏雷，刘景利，王晓龙，张峣，孙振峰，朱庆虎，王子敬，牛卉颖，
申请(专利权)人：哈尔滨维科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23