一种提高重组禽流感病毒感染鸡胚能力的方法，属于兽用生物制品技术领域。为了解决重组禽流感病毒在鸡胚中繁殖效果不佳，进而导致抗原液病毒含量低，疫苗生产成本高，免疫效果差的问题，本发明专利技术提供了一种提高重组禽流感病毒感染鸡胚能力的方法，该方法针对鸡胚在孵化过程中由于鸡胚组织分化速度加快产生大量的生理热，影响鸡胚的发育的问题，降低孵化温度，并加入生产因子、氨基酸、无机盐等防止孵化温度过低影响鸡胚活性及机体代谢，促进鸡胚组织分化，进而提高病毒在鸡胚中的繁殖，提高抗原液病毒含量，提高疫苗的免疫效果。本发明专利技术提供的该方法能够用于禽流感疫苗的生产。的该方法能够用于禽流感疫苗的生产。
【技术实现步骤摘要】
一种提高重组禽流感病毒感染鸡胚能力的方法
[0001]本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种提高重组禽流感病毒感染鸡胚能力的方法。
技术介绍
[0002]高致病性禽流感(avianinfluenza，AI)是由A型流感病毒引起的烈性呼吸道疾病，被世界动物卫生组织(OIE)定为A类传染病，AI不仅给世界养禽业造成了巨大的经济损失，而且严重威胁着人类生命安全，AI防控成了目前人兽共患传染病研究的焦点。
[0003]在目前禽流感疫苗生产中，鸡胚培养是常用的病毒培养方式之一，以采用非免疫鸡胚进行生产为主。在实际生产中发现，目前实现商品化的重组禽流感毒株在培养过程中多为利用SPF鸡胚、非免疫鸡胚，接种病毒后36
‑
37℃孵化，病毒在鸡胚中繁殖效果不佳，代表病毒含量的HA值和代表病毒感染能力的EID
50
值较低，而病毒液的HA和EID
50
的结果将直接影响疫苗的免疫效果。此外，按照生产标准要求的抗原液需要进行3
‑
5倍数浓缩，此时收获禽流感病毒液的HA值和EID
50
值的高低决定着疫苗的生产成本。因此提高疫苗半成品抗原液的病毒含量才能保证疫苗的优质高效并降低生产成本。
技术实现思路
[0004]为了解决病毒在鸡胚中繁殖效果不佳，进而导致抗原液病毒含量低，疫苗生产成本高，免疫效果差的问题，本专利技术提供了一种提高重组禽流感病毒感染鸡胚能力的方法，包括如下步骤：
[0005](1)将稀释后的重组禽流感病毒的原始种子病毒液接种于SPF鸡胚，接种量为每胚0.1mL，于33
‑
34℃培养72h，剔除死胚，活胚冷藏后，取HA效价为10log2
‑
11log2，EID
50
为10
9.0
‑
10
10.0
EID
50
/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID
50
值不能达到要求水平，选取HA、EID
50
值最高的)鸡胚病毒液进行收获，即得F0代种子病毒液；
[0006](2)取步骤(1)获得的F0代病毒液，进行稀释后接种于SPF鸡胚，接种量为每胚0.1mL，于33
‑
34℃培养72h，剔除死胚，活胚冷藏后，选取HA效价为10log2
‑
11log2，EID
50
为10
9.0
‑
10
10.0
EID
50
/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID
50
值不能达到要求水平，选取HA、EID
50
值最高的)的鸡胚病毒液进行收获，即得F1代种子病毒液；
[0007](3)取步骤(2)获得的F1代病毒液，进行稀释后接种于SPF鸡胚，接种量为每胚0.1mL，于33
‑
34℃培养72h，剔除死胚，活胚冷藏后，选取HA效价为10log2
‑
11log2，EID
50
为10
9.0
‑
10
10.0
EID
50
/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID
50
值不能达到要求水平，选取HA、EID
50
值最高的)的鸡胚病毒液进行收获，即得F2代种子病毒液；
[0008]所述稀释所用稀释液的组成为碱性成纤维生长因子1
‑
1.5ng/mL，EDTA螯合锌1
‑
3mg/mL，无水硫酸镁0.5
‑
1mg/mL，L
‑
盐酸赖氨酸0.1
‑
0.5mg/mL，余量为磷酸盐缓冲溶液，pH为7.2
‑
7.4。
[0009]进一步地限定，步骤(1)所述稀释的稀释度为10
‑4。
[0010]进一步地限定，步骤(2)所述稀释的稀释度为10
‑5‑
10
‑
10
。
[0011]进一步地限定，步骤(3)所述稀释的稀释度为10
‑5‑
10
‑
10
。
[0012]进一步地限定，所述方法中SPF鸡胚的日龄为11日龄。
[0013]进一步地限定，所述方法中的冷藏温度为2
‑
8℃。
[0014]进一步地限定，所述方法中的冷藏时间为12
‑
18h。
[0015]进一步地限定，所述磷酸盐缓冲溶液的组成为NaCl8.0g/L，KCl0.2g/L，KH2PO40.2g/L，Na2HPO412H2O2.9g/L，余量为水，pH为7.2
‑
7.4。
[0016]进一步地限定，所述重组禽流感病毒包括重组禽流感病毒H5N8亚型H5
‑
Re14株，重组禽流感病毒H5N6亚型H5
‑
Re13株，重组禽流感病毒H7N9亚型H7
‑
Re4株。
[0017]本专利技术还提供了上述方法获得的种子病毒液。
[0018]本专利技术的有益效果：
[0019]本专利技术提供了一种提高重组禽流感病毒感染鸡胚能力的方法，该方法针对鸡胚在孵化过程中由于鸡胚组织分化速度加快产生大量的生理热，影响鸡胚的发育的问题，降低孵化温度，并加入生产因子、氨基酸、无机盐等防止孵化温度过低影响鸡胚活性及机体代谢，促进鸡胚组织分化，进而提高病毒在鸡胚中的繁殖，提高抗原液病毒含量，提高疫苗的免疫效果，能够用于禽流感疫苗的生产。
具体实施方式
[0020]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体的实施方式对本专利技术进行进一步详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法，所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
[0021]本专利技术涉及的重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗由重组禽流感病毒H5N6亚型H5
‑
Re13株，重组禽流感病毒H5N8亚型H5
‑
Re14株和重组禽流感病毒H7N9亚型H7
‑
Re4株制备获得，为现有的农业部批准生产的兽用高致病性禽流感疫苗，已于2022年1月批准上市。
[0022]毒种来源：本专利技术涉及的重组禽流感病毒H5N6亚型H5
‑
Re13株，重组禽流感病毒H5N8亚型H5
‑
Re14株和重组禽流感病毒H7N9亚型H7
‑
Re4株均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室发放。
[0023]鸡胚来源：SPF鸡胚和非免疫鸡胚来源于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽类实验动物资源库。
[0024]鸡胚的发育到中期阶段，尤其是本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种提高重组禽流感病毒感染鸡胚能力的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将稀释后的重组禽流感病毒的原始种子病毒液接种于SPF鸡胚，接种量为每胚0.1mL，于33
‑
34℃培养72h，剔除死胚，活胚冷藏后，取HA效价为10log2
‑
11log2和10
9.0
‑
10
10.0
EID
50
/mL的鸡胚病毒液进行收获，即得F0代种子病毒液；(2)取步骤(1)获得的F0代病毒液，进行稀释后接种于SPF鸡胚，接种量为每胚0.1mL，于33
‑
34℃培养72h，剔除死胚，活胚冷藏后，选取HA效价为10log2
‑
11log2和10
9.0
‑
10
10.0
EID
50
/mL的鸡胚病毒液进行收获，即得F1代种子病毒液；(3)取步骤(2)获得的F1代病毒液，进行稀释后接种于SPF鸡胚，接种量为每胚0.1mL，于33
‑
34℃培养72h，剔除死胚，活胚冷藏后，选取HA效价为10log2
‑
11log2和10
9.0
‑
10
10.0
EID
50
/mL的鸡胚病毒液进行收获，即得F2代种子病毒液；所述稀释所用稀释液的组成为碱性成纤维生长因子1
‑
1.5ng/mL，EDTA螯合锌1
‑
3mg/mL，无水硫酸镁0.5
‑
【专利技术属性】
技术研发人员：迟超，王青竹，王宁，毛胜刚，张小灵，郭兴福，
申请(专利权)人：哈尔滨维科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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