本发明专利技术公开一种I群8型禽腺病毒全悬浮的培养方法，属于病毒扩增生物技术领域。为了提高禽腺病毒的培养后的活力。一种I群8型禽腺病毒全悬浮的培养方法是将I群8型禽腺病毒接种于LMH细胞无血清悬浮细胞系中，利用WAVETM波浪式生物反应器进行培养。该方法可以大量降低生产成本，而且生产周期短、病毒含量高，提高了培养过程中的传氧系数，减少生产耗时，提高了生产效率和疫苗的产量及质量。生产效率和疫苗的产量及质量。生产效率和疫苗的产量及质量。
【技术实现步骤摘要】
一种I群8型禽腺病毒全悬浮的培养方法
[0001]本专利技术属于病毒扩增生物
，具体涉及一种I群8型禽腺病毒全悬浮的培养方法。
技术介绍
[0002]禽腺病毒(FAdV)广泛存在于鸡群中，主要引起鸡包涵体肝炎(FAdV
‑
8b)、心包积水综合征(FAdV
‑
4)外还引起产蛋下降和肌胃糜烂等症状。该病的特点就是感染率高、病原复杂，常与一些能导致禽类呼吸道疾病相关的病原微生物混合感染或者在免疫抑制时发生疾病，从而造成严重的损失，该病在所有养禽的国家基本上均有发生，对该病的防控已经成为国际禽病研究中的热点问题。
[0003]禽腺病毒是一种双股DNA无囊膜病毒，直径70～90nm之间，二十面立体对称结构，实验室分离该病毒主要是接种鸡肝癌上皮细胞(LMH)，目前禽腺病毒的培养主要都采用贴壁的LMH细胞，该传统工艺生产半成品抗原效价低，不仅影响免疫效果而且直接影响疫苗成本及价格，悬浮培养大多采用生物反应器培养，传统的生物反应器在使用前需要对罐体进行清洗、灭菌及验证等工作，增加了生产耗时及污染的可能；而且罐体的搅拌桨在培养过程中对悬浮细胞会产生一定的剪切力，从而产生对细胞的持续性损伤，降低细胞的存活率，影响产毒效率；另外受传统罐体的结构设计影响导致了其传氧效率方面有待提高。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的是为了提高禽腺病毒的培养后的活力。
[0005]本专利技术提供一种I群8型禽腺病毒全悬浮的培养方法，所述培养方法是将I群8型禽腺病毒接种于LMH细胞无血清悬浮细胞系中，利用WAVETM波浪式生物反应器进行培养。
[0006]进一步地限定，获得LMH细胞无血清悬浮细胞系的方法如下：
[0007]步骤1：制备含有3％
‑
8％血清的培养液；
[0008]步骤2：将LMH贴壁细胞在含有8％血清的培养液中培养，然后将细胞移植在血清含量梯度降低的培养液中培养；
[0009]步骤3：将步骤2中获得的细胞进行消化后放置在无血清全悬浮培养基中培养，获得LMH细胞无血清悬浮细胞系。
[0010]进一步地限定，步骤2的步骤如下：将LMH贴壁细胞接种在培养液中按照1:3比例传代，传代3～5代后，将培养液中的血清浓度下降，连续传代5代以上，获得培养后的LMH贴壁细胞，再将血清浓度下降得到低血清培养液，将低血清培养液培养步骤1获得的培养后的LMH贴壁细胞，按照1:4比例传代。
[0011]进一步地限定，步骤1中所述将培养液中的血清浓度下降为5％，所述低血清培养液中的血清为3％。
[0012]进一步地限定，步骤3的步骤如下：
[0013]步骤3.1：选择长满单层的LMH细胞进行消化，将消化后的细胞接种至LMH细胞全悬
浮培养基培养，控制细胞的密度为1.5～2.0
×
106cells/ml；
[0014]步骤3.2：重复步骤3.1，保持48h时活细胞密度3.0～4.0
×
106cells/ml且活率高于90％，即获得LMH细胞无血清悬浮细胞系。
[0015]进一步地限定，步骤3.1中控制细胞的密度是在消化后的细胞接种至LMH细胞全悬浮培养基培养48小时的时候。
[0016]进一步地限定，步骤3中消化的方法是将长满单层的细胞上清液弃掉，加入2
‑
5mlPBS洗2次，弃掉PBS，加入0.25％的胰酶作用1min后弃掉胰酶，1min后加入准备好的培养基终止消化，将细胞吹匀备用。
[0017]进一步地限定，利用WAVETM波浪式生物反应器进行培养的方法如下：
[0018]步骤1：将LMH细胞无血清悬浮细胞以1.5～2.0
×
106cells/ml初始细胞密度接种于500ml摇瓶中，置于37℃、5％CO2、转速为100rpm的振荡培养箱中培养48～72小时；
[0019]步骤2：将步骤1获得的LMH细胞无血清悬浮细胞接种于2L的细胞培养袋，工作体积为1L，初始接种密度为1.0～1.5
×
106cells/ml，控制WAVETM波浪式生物反应器的反应条件，细胞密度达到3～4
×
106cells/ml，控制细胞活力在90％以上，则该细胞可以用于接毒试验；
[0020]步骤3：通过补料泵将I群8型禽腺病毒输入步骤2中的细胞培养袋中，接毒量为1
‰
，待细胞活率降至50％～60％收获病毒液，收获I群8型禽腺病毒；
[0021]步骤4：取LMH全悬浮细胞，导入10L的灌注用细胞培养袋，工作体积为5L，初始细胞密度1.0～1.5
×
106cells/ml，控制WAVETM波浪式生物反应器的反应条件，当细胞密度增长至3～4
×
106cells/ml时，接种步骤3获得的I群8型禽腺病毒，接毒量为1
‰
，待细胞活率降至45％～55％收获病毒液，收获I群8型禽腺病毒；
[0022]步骤5：取LMH全悬浮细胞，导入50L的灌注用细胞培养袋，工作体积为25L，初始细胞密度1.0～1.5
×
106cells/ml，控制WAVETM波浪式生物反应器的反应条件，当细胞密度增长至3～4
×
106cells/ml时接种步骤4获得的I群8型禽腺病毒，接毒量为1
‰
，待细胞活率降至45％～55％收获病毒液，收获I群8型禽腺病毒。
[0023]进一步地限定，步骤3
‑
5中所述的WAVETM波浪式生物反应器的反应条件为摇动速度设定为25r/min，摇动角度为6
°
，通气流速为0.2L/min，pH设定为7.10，DO设定为40％。
[0024]本专利技术提供上述的培养方法在制备腺病毒的疫苗中的应用。
[0025]有益效果：本专利技术提供一种I群8型禽腺病毒全悬浮的培养方法，该方法较传统贴壁培养可以大量降低生产成本，而且生产周期短、病毒含量高；同时去除了应用传统生物反应器培养过程中的清洗、灭菌及验证等工作，避免了交叉污染及剪切力的影响，还提高了培养过程中的传氧系数，减少生产耗时，提高了生产效率和疫苗的产量及质量。
附图说明
[0026]图1为获得的LMH悬浮细胞株的图片；
[0027]图2为LMH悬浮细胞接种FAdV
‑
8b型72h产生的CPE照片及细胞对照图；
[0028]图3为抗体ELISA检测结果(S/P值)；A1
‑
G1及A2
‑
H2为免疫后7d血清样品；A3
‑
G3及A4
‑
H4为免疫后14d血清样品；A5、B5为阴性对照；C5、D5为阳性对照；阳性判定标准为S/P>0.5为阳性；
[0029]图4为剖检肝脏病变照片；A和B为对照组鸡攻毒后出现肝脏肿大；C和D为免疫组鸡攻毒后肝脏正常，本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种I群8型禽腺病毒全悬浮的培养方法，其特征在于，所述培养方法是将I群8型禽腺病毒接种于LMH细胞无血清悬浮细胞系中，利用WAVETM波浪式生物反应器进行培养。2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，获得LMH细胞无血清悬浮细胞系的方法如下：步骤1：制备含有3％
‑
8％血清的培养液；步骤2：将LMH贴壁细胞在含有8％血清的培养液中培养，然后将细胞移植在血清含量梯度降低的培养液中培养；步骤3：将步骤2中获得的细胞进行消化后放置在无血清全悬浮培养基中培养，获得LMH细胞无血清悬浮细胞系。3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤2的步骤如下：将LMH贴壁细胞接种在培养液中按照1:3比例传代，传代3～5代后，将培养液中的血清浓度下降，连续传代5代以上，获得培养后的LMH贴壁细胞，再将血清浓度下降得到低血清培养液，将低血清培养液培养步骤1获得的培养后的LMH贴壁细胞，按照1:4比例传代。4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，步骤1中所述将培养液中的血清浓度下降为5％，所述低血清培养液中的血清为3％。5.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤3的步骤如下：步骤3.1：选择长满单层的细胞进行消化，将消化后的细胞接种至LMH细胞全悬浮培养基培养，控制细胞的密度为1.5～2.0
×
106cells/ml；步骤3.2：重复步骤3.1，保持48h时活细胞密度3.0～4.0
×
106cells/ml且活率高于90％，即获得LMH细胞无血清悬浮细胞系。6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，步骤3.1中控制细胞的密度是在消化后的细胞接种至LMH细胞全悬浮培养基培养48小时的时候。7.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤3中消化的方法是将长满单层的细胞上清液弃掉，加入2
‑
5mlPBS洗2次，弃掉PBS，加入0.25％的胰酶作用1min后弃掉胰酶，1min后加入准备好的培养基终止消化，将细胞吹匀备用。8.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，利用WAVETM波浪式生物反应器进行培养的方法如下：步骤1：将LMH细胞无血清悬浮细胞以1.5～...
【专利技术属性】
技术研发人员：高艳，高宏雷，张峣，王晓龙，刘景利，
申请(专利权)人：哈尔滨维科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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