一种牛肠道病毒分离株及其应用制造技术

一种牛肠道病毒分离株及其应用，该病毒的分类命名为牛肠道病毒bovine enterovirus（BEV），该病毒已于2020年7月17日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行的保藏，保藏编号为CCTCC NO:V202028。本发明专利技术中的病毒HB1901可在MDBK细胞中高效增殖，病毒浓度可达10

【技术实现步骤摘要】
一种牛肠道病毒分离株及其应用


[0001]本专利技术属于病毒分子生物学和基因克隆
，具体涉及一种牛肠道病毒分离株及其应用。

技术介绍

[0002]牛肠道病毒(Bovine enterovirus，BEV)属于小RNA病毒科，肠道病毒属，近年来在中国牛场中广泛传播。牛肠道病毒感染与牛的腹泻和呼吸道疾病相关。本专利技术中选用的牛肠道病毒HB1901毒株是在河北某牧场爆发严重腹泻的牛群中分离出来的，经基因分析后发现其属于BEV
‑
F型。由于牛肠道病毒致病力较低，且稳定性好，是构建病毒载体的理想毒株。此外反向遗传系统是研究病毒复制机制、致病机理和疫苗研发的重要工具。
[0003]BEV的反向遗传方面，2013年于力等人通过在5
’
端引入T7 RNA聚合酶进行细胞外转录，构建了牛肠道病毒cDNA感染性克隆。随后在牛肠道病毒VP1基因B
‑
C loop和D
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E loop中分别插入口蹄疫病毒(O型)的保守中和表位8E8，得到的重组病毒可以拯救成功，并且可以稳定传代。肌肉接种小鼠后，可在小鼠体内引起抗口蹄疫病毒的IgG抗体，该结果表明BEV 可作为疫苗载体。此外张海丽等人，张姗等人以及刘丹等人均通过引入T7启动子构建了BEV 的反向遗传操作系统。在已有的BEV感染性克隆中都是以T7启动子体外转录的操作系统，而本专利技术中构建的系统是基于CMV真核表达启动子的，该系统的优势在于不需要在体外将质粒转录成RNA后再转染至细胞，可直接将质粒转染至细胞中，此操作过程大大简便且极大地节约了成本。此外，本专利技术是国内外首次成功将绿色荧光蛋白GFP插入到BEV中，这不仅可以对病毒进行可视化分析，同时也表明BEV可容纳更大的外源基因片段，这对研发BEV 的基因工程疫苗提供了支持。

技术实现思路

[0004]解决的技术问题：本专利技术提供一种牛肠道病毒分离株及其应用，为研究BEV复制机制、致病机理和疫苗研发提供了重要工具，还可为其他肠道病毒属或者RNA病毒的反向遗传学系统的构建和研究提供科学参考。
[0005]技术方案:一种牛肠道病毒分离株HB1901，该病毒的分类命名为牛肠道病毒bovineenterovirus(BEV)，该病毒已于2020年7月17日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行的保藏，保藏编号为CCTCC NO:V202028。地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号。
[0006]上述牛肠道病毒分离株HB1901的基因，序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]上述牛肠道病毒分离株HB1901的基因，所述病毒的基因序列中插入有GFP。
[0008]含有上述牛肠道病毒分离株HB1901的载体。
[0009]上述牛肠道病毒分离株HB1901基因翻译的氨基酸序列，序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]含有上述载体的重组菌或重组细胞。
[0011]上述重组细胞为牛肾细胞。
[0012]上述牛肠道病毒分离株HB1901在构建病毒载体中的应用。
[0013]具体内容为：
[0014]1、从牛粪便样品中分离出牛肠道病毒。
[0015]2、对病毒粒子进行电镜观察(图1)。
[0016]3、在感染病毒的细胞上清液中提取BEV的基因组。
[0017]4、通过PCR扩增了覆盖整个病毒基因组的三个片段，然后组装到低拷贝载体pBluescriptskII。同时在病毒基因组5'端有CMV启动子，此元件主要用于在真核细胞中启动DNA转录。随后在此基础上，在基因组5
’
UTR和VP4基因之间利用SOE PCR引入外源绿色荧光蛋白GFP，构建了p
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GFP
‑
HB1901的全长感染性克隆(图2图3)。
[0018]5、将构建好的重组质粒进行全长测序，与原毒株HB1901全长序列相比发现存在6个核苷酸突变(表1)。随后将质粒转染至BHK
‑
21细胞中，转染后48h即可见到绿色荧光(图4)，测定病毒滴度达到10
5.1
TCID50/mL。转染得到的重组病毒r
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GFP
‑
HB1901在BHK
‑
21细胞中传代三次后得到第三代病毒，提取病毒上清RNA并进行测序，未发现新的突变，表明 r
‑
GFP
‑
HB1901重组病毒可以在细胞中传代后保持遗传稳定。
[0019]表1
[0020][0021]6、将重组的r
‑
GFP
‑
HB1901病毒和原毒株HB1901在MDBK细胞中进行噬斑试验，发现重组病毒在体外感染细胞系后，滴度略低于亲代病毒(图5)。
[0022]7、将重组的r
‑
GFP
‑
HB1901病毒在BHK
‑
21细胞中的复制曲线和亲代病毒在细胞上的复制曲线进行比较，发现重组病毒在体外感染细胞系后，病毒的复制效率略低于亲代病毒(图 9)。
[0023]有益效果：本专利技术中的病毒HB1901可在MDBK细胞中高效增殖，病毒浓度可达 10
6.0
TCID
50
/mL，无外源病毒污染；所构建的感染性克隆质粒可直接转染至真核细胞中，无需转录成RNA后再转染，操作简便，成本低廉；携带外源绿色荧光蛋白GFP，并可在细胞中稳定表达。
附图说明
[0024]图1为本专利技术中牛肠道病毒细胞病变图(左为细胞病变，右为阴性细胞)；
[0025]图2为本专利技术中病毒粒子电镜图(左为100nm电镜图，右为50nm电镜图)；
[0026]图3为本专利技术中感染性克隆构建示意图；
[0027]图4为本专利技术中PCR扩增图；(M为MARKER；1为CMV启动子；2为分段1；3为分段2；4为分段3；N为阴性对照)；
[0028]图5为本专利技术中克隆株绿色荧光表达图；
[0029]图6为间接免疫荧光图；
[0030]图7为Western Bloting图；
[0031]图8为空斑图(左图为亲本株，右图为克隆株)；
[0032]图9为克隆株与亲本株生长曲线图。
[0033]具体实施方法
[0034]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本专利技术，而不能用来限制本专利技术，所有与本专利技术相同或相近的技术方案均在本专利技术的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。
[0035]构建方案：通过选择BstZ17 I和EcoR V这两个个酶切位点将整个病毒分为3个部分，利用同源重组的方式将3个片段连接在一起，随后通过重叠PCR在病毒5
’
端前引入CMV启动子。拯救成功后，在5
’
UTR和VP4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牛肠道病毒分离株HB1901，该病毒的分类命名为牛肠道病毒bovine enterovirus（BEV），该病毒已于2020年7月17日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行的保藏，保藏编号为CCTCC NO:V202028。2.权利要求1 所述牛肠道病毒分离株HB1901的基因，其特征在于，序列如SEQ ID NO.1 所示。3.根据权利要求2 所述牛肠道病毒分离株HB1901的基因，其特征在于，所述病毒的基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘子豪，季程远，马家乐，姚火春，王凯民，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：