热稳定肠道病毒A组71型病毒株及其筛选方法和应用技术

本发明专利技术提供一种热稳定肠道病毒A组71型病毒株及其筛选方法和应用，该热稳定肠道病毒A组71型病毒株的保藏编号为CCTCCNo.V202233，细胞表型为52℃热处理后在细胞上稳定生长，并且表现出高产、高免疫原性的特性。与野生株或热不稳定株相比，该热稳定病毒株的编码区共产生5个核苷酸突变，其中错义突变3个，同义突变2个，可应用于灭活疫苗株的筛选、改造以及疫苗生产等方面。生产等方面。生产等方面。

【技术实现步骤摘要】
热稳定肠道病毒A组71型病毒株及其筛选方法和应用


[0001]本专利技术涉及病毒学
，具体涉及一种热稳定肠道病毒A组71型病毒株及其筛选方法和应用。

技术介绍

[0002]手足口病(Hand、Foot and Mouth Disease，HFMD)是由多种肠道病毒引起的急性传染病，多发于5岁以下的儿童。其临床症状主要表现为手、足和口腔黏膜等处疱疹，部分患者伴随着发热，少数患者出现心肌炎、无菌性脑炎、心脏衰竭、肺炎、肺水肿和弛缓性麻痹等严重并发症，甚至导致死亡。
[0003]HFMD的致病原包括多种血清型的肠道病毒，最常见的病原为肠道病毒A组71型(EV
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A71)、柯萨奇病毒A组16型(CV
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A16)、柯萨奇病毒A组6型(CV
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A6)和柯萨奇病毒A组10型(CV
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A10)。
[0004]EV
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A71属于小RNA病毒科肠道病毒属，肠道病毒颗粒呈二十面体球形对称，直径约为27～30nm，基因组为约7400nt的单股正链RNA。EV
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A71病毒结构蛋白由前体蛋白经蛋白酶作用剪切为VP4、VP2、VP3、VP1组成，VP1
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VP3位于病毒粒子的表面，VP4与病毒RNA相连位于病毒粒子的内部。肠道病毒存在空心颗粒和实心颗粒两种不同沉降系数的病毒颗粒。EP包含VP0、VP2、VP3三种结构蛋白，不具有感染性。FP包含VP1～VP4四种结构蛋白，VP0成熟剪切为VP4和VP2，病毒颗粒内部包含病毒RNA，是具有感染性的成熟病毒颗粒。
[0005]目前，常见EV
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A71病毒株的热稳定性较差，免疫原性和病毒颗粒产量有待提升。

技术实现思路

[0006]基于此，有必要提供一种热稳定肠道病毒A组71型病毒株及其筛选方法和应用，该肠道病毒A组71型病毒株在52℃处理30min后仍能在细胞上增殖，且病毒颗粒产量和体液免疫原性显著提高。
[0007]本专利技术采用如下技术方案：
[0008]本专利技术提供一种热稳定肠道病毒A组71型病毒株，细胞表型为经52℃热处理后能够在Vero细胞上稳定生长，变异的氨基酸位点如下：VP1蛋白第44位氨基酸为丙氨酸，第247位氨基酸为缬氨酸；2A蛋白第45位氨基酸为丙氨酸。该EV
‑
A71病毒株在2022年5月24日保藏与中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo.V202233。其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示。
[0009]热稳定肠道病毒A组71型病毒株的病毒母株为分离于2019年中国江苏省沛县手足口病患者0227号样品，经52℃热处理30分钟后不再具有感染性，在Vero细胞上不能生长，其VP1蛋白第44位氨基酸为缬氨酸，VP1蛋白第247位氨基酸为亮氨酸(L)，2A蛋白第45位氨基酸为苏氨酸。
[0010]两毒株核苷酸序列和氨基酸序列长度相同，基因组核苷酸及氨基酸序列具有的共同特征如下：基因组由非编码区5
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UTR、3
’‑
UTR和结构蛋白VP4，VP2，VP3，VP1及非结构蛋白
2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D编码区组成。基因组长度均为7403个核苷酸残基，非编码区5
’‑
UTR、3
’‑
UTR在基因组的核苷酸位置分别为1
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742和7325
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7403，3
’‑
UTR后带长度未确定的多聚A尾，编码的多聚蛋白(Polyprotein)长度为2194个氨基酸残基。
[0011]与野生株或热不稳定株相比，热稳定肠道病毒A组71型病毒株的编码区共产生5个核苷酸突变，其中错义突变3个，同义突变2个。编码区3个错义突变核苷酸和相应氨基酸位置分别为：VP1
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T2568C/V44A、VP1
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T3176G/L247V、2A
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A3461G/T45A；编码区2个同义突变的核苷酸位置分别为：2A
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T3715C和3A
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T5065C。
[0012]本专利技术还提供上述热稳定肠道病毒A组71型病毒株的筛选方法，包括如下步骤：将病毒母株EV
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A71TS
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/JS PX/2019样品52℃条件下处理30min，立即4℃保存；热处理的病毒母株冷却后，接种Vero细胞，置于37℃培养箱培养至细胞出现病变；反复冻融多次，并采用重复上述步骤的方式连续热处理继续多代培养，收获经热处理筛选的病毒液；将经热处理筛选的病毒液接种于Vero细胞，进行空斑纯化，得热稳定EV
‑
A71TS+/JS PX/2019病毒株收获液，即得。
[0013]在其中一些实施例中，所述空斑纯化的步骤为：将经热处理筛选的病毒液接种于Vero细胞再次置于52℃处理30min后10倍连续多次稀释病毒，优选共稀释6个梯度；分别加入6孔板中，37℃吸附一段时间后弃去病毒液；将2％的低熔点琼脂糖与2
×
DMEM维持液按1:1等体积混合，加入6孔板各孔，待其凝固后置于孵箱；2
‑
3天后观察结果，在最低稀释度挑出噬斑；连续三次空斑纯化得到克隆毒株；将克隆株在Vero细胞上以低MOI连续盲传三代，得到热稳定株病毒收获液。
[0014]本专利技术还提供一种热稳定肠道病毒A组71型病毒株病毒颗粒的纯化方法，包括如下步骤：采用热稳定肠道病毒A组71型病毒株接种于Vero细胞；待细胞90％以上发生病变，收获病毒，依次经超滤浓缩、蔗糖垫底离心、蔗糖密度梯度离心、CsCl密度梯度离心，超速离心除盐，收获病毒颗粒，检测空心颗粒和实心颗粒的抗原含量，并对病毒颗粒进行灭活。
[0015]上述纯化方法获得的热稳定肠道病毒A组71型病毒株病毒颗粒作为候选疫苗的应用。
[0016]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0017]本专利技术首次通过热处理方式使用Vero细胞进行分离、传代和适应培养，获得了热稳定肠道病毒A组71型病毒株病毒，细胞表型为52℃热选择压力处理后在细胞上稳定生长，并且表现出高产、高免疫原性的特性。本专利技术还提供该热稳定EV
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A71毒株、病毒实心颗粒(Full Particle,FP)和空心颗粒(Empty particle,EP)的分离鉴定方法及体液免疫原性测定方法，可应用于灭活疫苗株的筛选、改造以及疫苗生产。
[0018]另外，本专利技术测得的热稳定相关的VP1基因及其它基因序列核苷酸、氨基酸位点，也可应用于EV
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A71外的其它肠道病毒高产、热稳定株的构建。依据结构蛋白基因序列位点的改变，可以构建EV
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A71及其它肠道病毒热稳定、高产、免疫原性强的病毒样颗粒(Virus
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种热稳定肠道病毒A组71型病毒株，细胞表型为经52℃热处理后能够在Vero细胞上稳定生长，变异的氨基酸位点如下：VP1蛋白第44位氨基酸为丙氨酸，第247位氨基酸为缬氨酸；2A蛋白第45位氨基酸为丙氨酸。2.根据权利要求1所述的热稳定肠道病毒A组71型病毒株，其特征在于，保藏编号为CCTCCNo.V202233。3.根据权利要求1所述的热稳定肠道病毒A组71型病毒株，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示。4.根据权利要求1至3任一项所述的热稳定肠道病毒A组71型病毒株，其特征在于，其病毒母株为分离于2019年中国江苏省沛县手足口病患者0227号样品，经52℃热处理30分钟后不再具有感染性，在Vero细胞上不能生长，其VP1蛋白第44位氨基酸为缬氨酸，VP1蛋白第247位氨基酸为亮氨酸(L)，2A蛋白第45位氨基酸为苏氨酸。5.一种权利要求1至4任一项所述的热稳定肠道病毒A组71型病毒株的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：将病毒母株EV
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A71TS
‑
/JS PX/2019样品52℃条件下处理30min，立即4℃保存；经热处理的病毒母株冷却后，接种Vero细胞，置于37℃培养箱培养至细胞出现病变；反复冻融多次，并采用重复上述步骤的方式连续热处理继续多代培养，收获经热处理筛选的病毒液；将...

【专利技术属性】
技术研发人员：申硕，刘睿伦，钱莎莎，吕诗韵，杨祥，王泽鋆，郭靖，孟胜利，
申请(专利权)人：武汉生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：