一株分泌维生素B6单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用制造技术

一株分泌维生素B6单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。本发明专利技术分泌维生素B6单克隆抗体杂交瘤细胞株MTB，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19183。首先合成维生素B6半抗原，再制备维生素B6完全抗原，免疫BALB/c小鼠，取高效价、低IC

【技术实现步骤摘要】
一株分泌维生素B6单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用


[0001]本专利技术涉及一株分泌维生素B6单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测


技术介绍

[0002]维生素B6代表一组具有高生物利用度的3
‑
羟基
‑2‑
甲基吡啶衍生物，包括吡哆醇，吡哆醛，吡哆胺及其磷酸化形式。维生素B6参与氨基酸，碳水化合物和脂质代谢中的多种酶促反应。此外维生素B6在神经系统功能，激素功能，血红蛋白合成中起重要作用。有趣的是，最近发现维生素B6偶联物是靶向协同癌症治疗中的潜在药物载体，人类无法在体内合成维生素B6。因此，仅能从膳食，补充剂和肠道菌群中获取维生素B6。维生素B6存在于多种食物中，包括家禽，小麦，坚果，鱼，牛奶，蔬菜和番茄中。尽管维生素B6缺乏症并不常见，但在某些特殊情况下维生素B6缺乏的风险很高。维生素B6缺乏会引起多种症状，例如抑郁，易怒，疲劳，发炎和贫血。为了预防和治疗维生素B6缺乏症，市面上有各种维生素B6强化食品和补充剂。因此，可靠地确定膳食及补充剂中的维生素B6含量是必需的。
[0003]目前，维生素B6含量分析方法主要是仪器方法及微生物法，最常用的定量分析技术有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、气质联用(GC
‑
MS)、液质联用(LC
‑
MS)等。尽管仪器方法准确，灵敏，但这些方法需要昂贵的仪器、专业的操作人员，复杂的提取步骤，成本高，时间长，不适用于在短时间内筛查大量测试样品。微生物法基于样品或标准品中维生素B6存在时微生物的生长，从而检测维生素B6含量。尽管微生物法具有高灵敏度和特异性，但其较长的孵育时间(通常20
‑
24小时)和复杂的步骤限制了目标物的快速检测。因此建立快速简便的维生素B6检测方法具有重要意义。
[0004]作为一种有效的替代方法，免疫测定方法如酶联免疫吸附测定(ELISA)具有简单，低成本和高效的优点，使其快速实现筛选目的。目前，使用免疫测定法同时检测几种分析物引起了越来越多的关注。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一株分泌维生素B6单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，由该细胞株制备的抗体对维生素B6具有较高的检测灵敏度，可以用来建立维生素B6的免疫学检测方法。
[0006]本专利技术的技术方案，一种分泌维生素B6单克隆抗体杂交瘤细胞株MTB，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19183。
[0007]一种维生素B6单克隆抗体，其由所述CGMCC No.19183的杂交瘤细胞株MTB分泌产生。
[0008]维生素B6半抗原的制备方法，化学反应方程式如下：
[0009][0010]步骤如下：
[0011]a、化合物2：化合物1和2，2
‑
二甲氧基丙烷溶解于丙酮，随后加入对甲苯磺酸，高温下搅拌过夜；将反应混合物冷却并倒入冰水中，二氯甲烷萃取水层，合并有机相，盐水洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩，所需产物用乙醚重结晶，过滤混合物，得到白色固体化合物2；
[0012]b、化合物3：在氮气条件下，将NaH溶液加入到THF中，在此悬浮液中加入溶解于THF中的化合物2；将所得混合物回流，回流期间产生大量沉淀物，冷却至室温后，逐滴加入苄基溴，并将所得混合物再次回流；室温下向混合物加入冰，然后与饱和氯化铵溶液混合，二氯甲烷萃取；收集有机萃取物，用盐水洗涤，干燥，浓缩，得到深棕色油状物；再通过二氧化硅柱纯化，得到棕色油状化合物3；
[0013]c、化合物4：化合物3溶解在蒸馏水中，加入甲酸，混合物搅拌，用饱和碳酸氢钠溶液调节pH，中和后用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，干燥并浓缩得到深棕色固体；粗产物通过柱色谱法纯化，得到白色固体化合物4；
[0014]d、化合物5：氮气条件下，将苄基二甲基苯基氯化铵溶解于无水甲醇，并加入甲醇
钠，然后向该混合物中加入溶解于甲醇溶液的化合物4，室温下搅拌后，旋蒸上述混合物，倒入装有热甲苯的圆底烧瓶中，反应后，浓缩混合物，将反应中将油状残余物溶于饱和氯化铵溶液，二氯甲烷萃取，合并有机相，干燥并浓缩；通过硅胶柱纯化，得到化合物5；
[0015]e、化合物6：化合物5溶解于二氯甲烷中，加入戴斯
‑
马丁氧化剂，室温搅拌过夜；将混合物倒入水中，乙胺萃取，合并有机层，盐水洗涤，经Na2SO4干燥浓缩，残余物通过硅胶柱纯化，得到黄色油状物化合物6；
[0016]f、化合物7：将化合物6和乙氧甲酰基亚甲基三苯基膦在四氢呋喃THF溶液中搅拌过夜，将混合物浓缩，混合物通过硅胶柱纯化，得到黄色固体化合物7；
[0017]g、化合物8：化合物7溶于乙酸乙酯溶液，加入NaBH4搅拌，然后加入CaCl2，室温反应；将混合物倒入水中，用乙胺稀释，过滤，用乙胺冲洗固体，滤液用乙胺萃取，合并有机层，盐水洗涤，经Na2SO4干燥浓缩，残余物通过硅胶柱纯化，得到黄色油油状化合物8；
[0018]h、化合物9：在室温下，向化合物8的二氯甲烷溶液中加入甲磺酰氯和三乙醇胺，搅拌过夜；将混合物倒入水中，用二氯甲烷萃取水层，合并有机层，盐水洗涤，经Na2SO4干燥浓缩，残余物通过硅胶柱纯化，得到黄色油状物化合物9；
[0019]i、化合物10：在室温下向化合物9的二甲亚砜溶液中加入NaCN，搅拌过夜，将混合物倒入水中；乙胺萃取，合并有机层，盐水洗涤，经Na2SO4干燥浓缩，残余物通过硅胶柱纯化，得到黄色油状物化合物10；，
[0020]j、化合物11：在室温下将化合物10在HCl/MeOH溶液中搅拌过夜，浓缩混合物，得到黄色油状物化合物11；
[0021]k、化合物12：向化合物11的MeOH的溶液中加入Pd(OH)2，室温氢气条件下搅拌过夜，过滤混合物并浓缩，得到黄色油状物化合物12；
[0022]l、化合物13：将化合物12溶于HCl中，室温搅拌过夜，过滤混合物并浓缩，得到棕色油状化合物13，即为维生素B6半抗原。
[0023]免疫原维生素B6‑
KLH的制备方法，步骤为：称取维生素B6半抗原溶解于N,N
‑
二甲基甲酰胺DMF中，加入N
‑
羟基琥珀酰亚胺NHS，室温反应；随后加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐EDC，室温反应得到反应液A；取蛋白KLH溶液，加入碳酸盐
‑
碳酸氢盐缓冲液，得到溶液B；随后，逐滴将反应液A液加入到溶液B液中，室温反应，即得偶联物维生素B6‑
KLH混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，最终得到免疫原维生素B6‑
KLH。
[0024]进一步地，具体步骤如下：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分泌维生素B6单克隆抗体杂交瘤细胞株MTB，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19183。2.一种维生素B6单克隆抗体，其特征在于：其由权利要求1所述CGMCC No.19183的杂交瘤细胞株MTB分泌产生。3.维生素B6半抗原的制备方法，其特征在于化学反应方程式如下：步骤如下：a、化合物2：化合物1和2，2
‑
二甲氧基丙烷溶解于丙酮，随后加入对甲苯磺酸，高温下搅拌过夜；将反应混合物冷却并倒入冰水中，二氯甲烷萃取水层，合并有机相，盐水洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩，所需产物用乙醚重结晶，过滤混合物，得到白色固体化合物2；b、化合物3：在氮气条件下，将NaH溶液加入到THF中，在此悬浮液中加入溶解于THF中的化合物2；将所得混合物回流，回流期间产生大量沉淀物，冷却至室温后，逐滴加入苄基溴，
并将所得混合物再次回流；室温下向混合物加入冰，然后与饱和氯化铵溶液混合，二氯甲烷萃取；收集有机萃取物，用盐水洗涤，干燥，浓缩，得到深棕色油状物；再通过二氧化硅柱纯化，得到棕色油状化合物3；c、化合物4：化合物3溶解在蒸馏水中，加入甲酸，混合物搅拌，用饱和碳酸氢钠溶液调节pH，中和后用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，干燥并浓缩得到深棕色固体；粗产物通过柱色谱法纯化，得到白色固体化合物4；d、化合物5：氮气条件下，将苄基二甲基苯基氯化铵溶解于无水甲醇，并加入甲醇钠，然后向该混合物中加入溶解于甲醇溶液的化合物4，室温下搅拌后，旋蒸上述混合物，倒入装有热甲苯的圆底烧瓶中，反应后，浓缩混合物，将反应中油状残余物溶于饱和氯化铵溶液，二氯甲烷萃取，合并有机相，干燥并浓缩；通过硅胶柱纯化，得到化合物5；e、化合物6：化合物5溶解于二氯甲烷中，加入戴斯
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马丁氧化剂，室温搅拌过夜；将混合物倒入水中，乙胺萃取，合并有机层，盐水洗涤，经Na2SO4干燥浓缩，残余物通过硅胶柱纯化，得到黄色油状物化合物6；f、化合物7：将化合物6和乙氧甲酰基亚甲基三苯基膦在四氢呋喃THF溶液中搅拌过夜，将混合物浓缩，混合物通过硅胶柱纯化，得到黄色固体化合物7；g、化合物8：化合物7溶于乙酸乙酯溶液，加入NaBH4搅拌，然后加入CaCl2，室温反应；将混合物倒入水中，用乙胺稀释，过滤，用乙胺冲洗固体，滤液用乙胺萃取，合并有机层，盐水洗涤，经Na2SO4干燥浓缩，残余物通过硅胶柱纯化，得到黄色油油状化合物8；h、化合物9：在室温下，向化合物8的二氯甲烷溶液中加入甲磺酰氯和三乙醇胺，搅拌过夜；将混合物倒入水中，用二氯甲烷萃取水层，合并有机层，盐水洗涤，经Na2SO4干燥浓缩，残余物通过硅胶柱纯化，得到黄色油状物化合物9；i、化合物10：在室温下向化合物9的二甲亚砜溶液中加入NaCN，搅拌过夜，将混合物倒入水中；乙胺萃取，合并有机层，盐水洗涤，经Na2SO4干燥浓缩，残余物通过硅胶柱纯化，得到黄色油状物化合物10；j、化合物11：在室温下将化合物10在HCl/MeOH溶液中搅拌过夜，浓缩混合物，得到黄色油状物化合物11；k、化合物12：向化合物11的MeOH的溶液中加入Pd(OH)2，室温氢气条件下搅拌过夜，过滤混合物并浓缩，得到黄色...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋珊珊，胥传来，曾露，匡华，徐丽广，孙茂忠，刘丽强，吴晓玲，胡拥明，郝昌龙，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：