分泌抗猫细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞3A6株及其应用制造技术

分泌抗猫细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞3A6株及其应用，属于生物领域，该杂交瘤细胞3A6株于2020年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：C2020248。该杂交瘤细胞3A6株既能与真核表达的VP2蛋白反应又能与猫细小病毒反应，生物学性能十分优良，制备的小鼠腹水单克隆抗体对病毒的中和效价高达5

【技术实现步骤摘要】
分泌抗猫细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞3A6株及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体公开了一种分泌抗猫细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞3A6株及其应用。

技术介绍

[0002]猫细小病毒病，又名猫瘟、猫泛白细胞减少综合征，是由猫细小病毒(Feline parvovirus，FPV)引起的一种以剧烈呕吐、腹泻、腥臭味粪便为主要表征的烈性传染病。该病以发病率高、传染性强、病程快、幼猫死亡率高为特点，是猫科动物最主要的传染性病毒病之一。FPV为细小病毒科细小病毒属的无囊膜单股负链DNA病毒，基因组全长5.2kb，编码NS1、NS2两种非结构蛋白及VP1、VP2、VP3三种结构蛋白。病毒的抗原表位通常位于其衣壳蛋白上，FPV病毒衣壳由60个结构蛋白组成，其中包括53～54个VP2蛋白，占衣壳蛋总量的90％，对FPV的抗原性起决定性作用。
[0003]目前预防该病使用的疫苗多为弱毒苗，但是许多幼猫在应用弱毒疫苗后仍会发生本病。分析原因，与母源抗体、疫苗效价、使用方法以及病毒变异有关。用弱毒疫苗免疫动物也未能得到完全保护，有许多免疫动物群体暴发猫细小病毒病，损失十分惨重。因此对猫细小病毒病除了积极的预防外，有必要对患病动物进行有效的治疗，将损失降到最小。猫细小病毒的高免血清常用于治疗猫细小病毒病，但制备成本较高，易传播其它病毒，抗体中和效价参差不齐，难以标准化。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种分泌抗猫细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞3A6株及其应用。本专利技术的一种分泌抗猫细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞3A6株为发展单克隆抗体介导的特异猫细小病毒病治疗应用奠定了基础。
[0005]本专利技术为解决技术问题所采用的技术方案如下：
[0006]本专利技术的分泌抗猫细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞3A6株，于2020年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：C2020248。
[0007]本专利技术的杂交瘤细胞3A6株在制备猫细小病毒病单克隆抗体3A6治疗剂中的应用。
[0008]采用本专利技术的杂交瘤细胞3A6株制备的猫细小病毒病单克隆抗体3A6治疗剂。
[0009]采用本专利技术的杂交瘤细胞3A6株制备的猫细小病毒VP2蛋白单克隆抗体。
[0010]本专利技术的猫细小病毒VP2蛋白单克隆抗体在制备猫细小病毒病单克隆抗体3A6治疗剂中的应用。
[0011]本专利技术的有益效果是：
[0012]本专利技术用纯化的猫细小病毒抗原免疫BALB/c小鼠，制备免疫脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞系融合，以真核表达的VP2蛋白和纯化的猫细小病毒进行双重筛选，获得一株既能与真核表达的VP2蛋白反应又能与猫细小病毒反应的单克隆抗体杂交瘤细胞株，命名为3A6。
[0013]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0014]1、本专利技术使用的BALB/C小鼠免疫原使用的是FPV当前流行毒株制备的。已有报道显示，筛选的VP2蛋白单克隆抗体的免疫原为原核表达系统表达的VP2蛋白，而本专利技术采用的VP2蛋白来源于昆虫杆状病毒表达系统(一种真核表达系统)，尽管VP2蛋白氨基酸序列高度保守，但是不同表达系统所产生的蛋白在蛋白翻译后修饰水平不一，因此其免疫抗原存在一定差异。
[0015]2、本专利技术从建立的55株分泌抗FPV单克隆抗体的杂交瘤细胞库中筛选出一株杂交瘤细胞3A6株，生物学性能十分优良，用其制备的小鼠腹水单克隆抗体对病毒的中和效价高达5
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108、对VP2蛋白的反应效价高达108(其效价显著高于现有资料报道的参数值)，并且对多种猫细小病毒毒株的中和能力相当，用于猫细小病毒感染发病猫的临床治疗，有效率达到100％。
[0016]3、采用本专利技术的杂交瘤细胞3A6株制备的猫细小病毒病单克隆抗体3A6治疗剂治疗效果显著，治愈率达100％，治疗周期约5天。
具体实施方式
[0017]本专利技术的分泌抗猫细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞3A6株，已于2020年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学保藏中心)，保藏编号为：CCTCC NO：C2020248。
[0018]本专利技术的杂交瘤细胞3A6株在制备猫细小病毒病单克隆抗体3A6治疗剂中的应用。
[0019]采用本专利技术的杂交瘤细胞3A6株制备的猫细小病毒病单克隆抗体3A6治疗剂。
[0020]采用本专利技术的杂交瘤细胞3A6株制备的猫细小病毒VP2蛋白单克隆抗体。
[0021]本专利技术的猫细小病毒VP2蛋白单克隆抗体在制备猫细小病毒病单克隆抗体3A6治疗剂中的应用。
[0022]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0023]实施例1单克隆抗体杂交瘤细胞3A6株的建立
[0024]1、FPV抗原的制备
[0025]将当前流行FPV强毒LYG
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18株(保存于江苏省农业科学院兽医研究所生物兽药研究室，病毒基因组序列信息已上传GenBank数据库，编号为：MW017574)接种于FK81细胞(购自ATCC细胞库)，待细胞出现完全病变后收集感染上清液，反复冻融三次，8000r/min离心3分钟，去除细胞碎片；收集上清，并加入PEG
6000
(Sigma公司产品)至终浓度为9％，再加入氯化钠至终浓度为3％，室温搅拌至溶解，4℃沉淀过夜。次日，采用8000r/min离心1小时，弃上清，用5mLTNE溶液(pH 7.8)重悬。将重悬液加入至50％
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30％
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10％的蔗糖梯度溶液，60000r/min超速离心3小时，收集分层的蛋白条带(30％
‑
10％间)，吸取病毒带，通过电镜负染观察病毒形态，采用BCA蛋白定量检测试剂盒(购自赛默飞世尔科技公司产品)确定病毒浓度，
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80℃保存备用。
[0026]2、动物免疫
[0027]用纯化的FPV免疫抗原经腹腔注射免疫8周龄雌性BALB/C小鼠(购自扬州大学比较医学实验中心)，50μg/只。首免用等体积弗氏完全佐剂(Sigma公司产品)乳化抗原，之后每隔14天用弗氏不完全佐剂(Sigma公司产品)如花抗原，再免疫2次。第3次免疫后的第6天断尾采血，用间接ELISA方法测定血清抗体效价，选取其血清抗体效价＞106的小鼠，在融合前3天用纯化的FPV抗原再次加强免疫。
[0028]3、细胞融合
[0029]采用PEG细胞融合方法，取生长状态良好的SP2/0骨髓瘤细胞(购自ATCC细胞库)与免疫的BALB/C小鼠脾细胞按数量比为1:5的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.分泌抗猫细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞3A6株，其特征在于，该杂交瘤细胞3A6株于2020年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：C2020248。2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞3A6株在制备猫细小病毒病单克隆抗体3A6治疗剂中的应...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏兴霞，毕振威，钱晶，王永山，王晶宇，诸玉梅，谭业平，欧阳伟，王晓丽，马孙婷，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：