使用同源重组改造间充质干细胞制造技术

本文提供了用于遗传修饰间充质干细胞、区分这些细胞并将这些细胞用于筛选和治疗疾病和病症的方法。

Reconstructing mesenchymal stem cells using homologous recombination

This article provides a method for genetic modification of mesenchymal stem cells, differentiating these cells and using these cells to screen and treat diseases and diseases.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用同源重组改造间充质干细胞本申请享有2014年11月11日提交的美国临时专利申请号62/078,000的优先权，其教导通过整体引用并入本申请。专利
本专利技术涉及间充质干细胞(MSC)领域，特别涉及用于修饰间充质干细胞的基因组和/或基因组DNA的方法和组合物。专利技术背景干细胞根据其来源组织可以分为胚胎干细胞或成体干细胞。成体干细胞的作用是在生物体一生中将已建立的成熟细胞类型库维持在基本稳定状态的数量。虽然具有高流失率的成体组织(例如血液、皮肤和肠上皮)通过组织特异性干细胞得到维持，但是干细胞本身很少分裂。然而，在某些情况下，例如在损伤后或移植后的组织修复期间，干细胞分裂可能变得更加频繁。造血干细胞作为成体干细胞的典型例子，已被证明在基因治疗中具有实用价值。虽然其在人体中相对稀少，但是这些细胞可以容易地从骨髓中分离出来，或者在流动到外周血中后分离出来。特异性表面标志物允许从骨髓或外周血细胞的混合群体中鉴定和富集造血干细胞。在体外操作之后，这些细胞可以通过注射进血液而再次移植到患者体内，在那里其响应于内源性刺激而行进到骨髓中其功能活跃的位置。已经外植的、体外操作过的以及再次移植进本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将目的多核苷酸引入间充质干细胞的基因组中安全港基因座的方法，所述方法包括将以下引入到所述间充质干细胞中：(a)上游的转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)，其包括与DNA切割结构域连接的上游DNA结合结构域，其中所述上游DNA结合结构域特异性结合所述间充质干细胞基因组中在基因组插入位点的上游位点处的安全港基因座，(b)下游的转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)，其包括与DNA切割结构域连接的下游DNA结合结构域，其中所述下游DNA结合结构域特异性地结合所述间充质干细胞基因组中在基因组插入位点的下游位点处的安全港基因座，和(c)单链或双链供体多核苷酸，其包括正义链多核苷酸突出端和/或反...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.11 US 62/078,0001.一种将目的多核苷酸引入间充质干细胞的基因组中安全港基因座的方法，所述方法包括将以下引入到所述间充质干细胞中：(a)上游的转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)，其包括与DNA切割结构域连接的上游DNA结合结构域，其中所述上游DNA结合结构域特异性结合所述间充质干细胞基因组中在基因组插入位点的上游位点处的安全港基因座，(b)下游的转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)，其包括与DNA切割结构域连接的下游DNA结合结构域，其中所述下游DNA结合结构域特异性地结合所述间充质干细胞基因组中在基因组插入位点的下游位点处的安全港基因座，和(c)单链或双链供体多核苷酸，其包括正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端，当在所述基因组插入位点处切割时，其与相应的被切割的基因组DNA的多核苷酸突出端互补，其中所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述被切割的基因组DNA的同源重组，从而将所述供体多核苷酸引入进所述基因组插入位点，进入所述间充质干细胞基因组的安全港基因座。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述上游TALEN与位于所述插入位点侧翼的基因组DNA基因座的正义链结合，并且所述下游TALEN与位于所述插入位点侧翼的基因组DNA基因组的反义链结合。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述引入包括核转染。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述引入包括使用核转染素(nucleofectinD).5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其包括以约1:1:1的比例使所述间充质干细胞与所述上游TALEN、所述下游TALEN和所述目的多核苷酸接触。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述供体多核苷酸编码用于诱导所述间充质干细胞增殖和/或分化成所选的成熟的细胞和/或组织的试剂，所述成熟的细胞和/或组织选自脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉、皮肤、肌细胞、神经元和胶质细胞。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述试剂是营养剂或生长因子。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述供体多核苷酸编码可选择的标志物和/或可检测的标记。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述供体多核苷酸包括谱系特异性启动子，所述谱系特异性启动子以可操作的方式与所述可选择的标志物和/或可检测的标记连接。10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述安全港基因座是AAVS1。11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述安全港基因座是CYBL。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述供体多核苷酸编码多肽。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述下游TALEN包括SEQIDNO：11。14.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA切割结构域包括FokI核酸酶结构域。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述FokI核酸酶结构域包括SEQIDNO：13。16.根据权利要求1所述的方法，其中所述结合所述上游TALEN的基因组正义链基因座包括SEQIDNO：1。17.根据权利要求1所述的方法，其中所述结合所述下游TALEN的基因组反义链位点包括SEQIDNO：3。18.根据权利要求1所述的方法，其中将所述供体多核苷酸插入进同一染色体的两个拷贝中。19.根据权利要求1所述的方法，其中所述上游TALEN包括SEQIDNO：7、SEQIDNO：8或者SEQIDNO：10所示的氨基酸序列。20.根据权利要求1所述的方法，其中所述下游TALEN包括SEQIDNO：11所示的序列。21.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞包含每条染色体的两个拷贝，并且其中将所述多核苷酸插入到同一染色体的所述两个拷贝中。22.一种修饰间充质干细胞的基因组DNA的方法，所述方法包括将以下引入所述细胞：(a)上游的转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)，其包括与DNA切割结构域连接的上游DNA结合结构域，其中所述上游DNA结合结构域特异性地结合目的基因组序列的上游位点，和(b)下游的转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)，其包括与DNA切割结构域连接的下游DNA结合结构域，其中所述下游DNA结合结构域特异性地结合目的基因组序列的下游位点，由此所述转录激活子样效应物核酸酶切割所述基因组DNA并且切除所述目的基因组序列，从而修饰所述细胞的基因组DNA。23.根据权利要求22所述的方法，其中通过切除基因组片段来修饰所述基因组。24.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·S·拉奥，曾宪民，
申请(专利权)人：应用干细胞有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US