DNA‑细胞缀合物制造技术

本发明专利技术通过将DNA与细胞表面上天然官能团相连接提供DNA和细胞的缀合物。所述细胞可以有或没有细胞壁。所述经修饰的细胞可与基底表面连接，以及可在测定或生物反应器中使用。

DNA cell conjugates

The present invention provides DNA and cell conjugates by linking DNA to the natural functional groups on the cell surface. The cells can have or have no cell walls. The modified cells can be connected to the substrate surface and can be used in the determination or bioreactor.

【技术实现步骤摘要】
DNA-细胞缀合物本申请是申请日为2010年4月8日、申请号为201080021350.6、专利技术名称为“DNA-细胞缀合物”的中国专利技术专利申请的分案申请。相关申请的交叉引用本专利申请主张2009年4月8日提交的美国专利申请No.61/167748和2009年9月16日提交的美国专利申请No.61/243123的优先权，以上专利申请出于所有目的以其整体并入本文。有关在联邦政府资助的研究或开发下完成的专利技术权利的声明本专利技术是在美国能源部所签订的并且由能源部和科学局、基础能源科学局的纳米尺度科学、工程和技术(NSET)项目所支持的合同No.DE-AC02-05CH11231、国家卫生研究院授予的资助号No.HG003329和R01GM072700以及国家卫生研究院分子生物物理学培训资助计划No.T32GM08295的政府支持下进行的。政府对本专利技术具有一定权利。对通过光盘提交的“序列表”、表格或计算机程序列表附录的参考不适用专利技术背景通常，已经在基于细胞的阵列中使用肽来捕获细胞用于研究。表面印制了设计用于结合细胞表面上整合素的“RGD”肽，但是该系统不能用于不具有整合素的细胞如非粘附细胞(例如白细胞、淋巴细胞)，并且不允许在同一平台上用不同细胞类型共同进行受控的限定的图案化。由于整合素是参与控制分化的受体，并且整合素结合后的活性与分化有关，因此RGD系统具有引起细胞分化并因此在进行分析之前改变细胞的巨大劣势。(参见Du,X.P.等人,Cell1991,65,409-416；Xiong,J.P.等人,Science2002,296,151-155。)使用蛋白质-蛋白质连接系统证明了间接非共价连接，其中DNA通过抗体-配体相互作用以非共价键间接地与细胞连接(BaileyRC等人,JAmChemSoc.2007Feb21；129(7):1959-67)。将针对细胞上靶配体特异性的抗体与DNA缀合。抗体和配体之间的非共价键是基于氢键作用的，即典型的蛋白质-蛋白质相互作用。将细胞表面配体特异性抗体上的单链DNA(ssDNA)寡聚物与具有那些配体的细胞相连，然后将所述细胞锚定到具有ssDNA互补寡聚物的表面上，所述ssDNA互补寡聚物与所述细胞上的配对链结合以捕获所述细胞。参见Chandra,R.A.等人,Angew.Chem.-Int.Edit.2006,45,896-901使用的代谢寡糖工程首先显示了合成单链DNA(ssDNA)链与活细胞表面的间接共价连接。这种间接共价是如下所述进行的：通过在引入DNA前用过乙酰化的N-叠氮基乙酰甘露糖胺(Ac4ManNAz)处理细胞(花费3天)后所获得的细胞表面唾液酸中所引入的特定化学柄(chemicalhandle)(叠氮化物)进行的。然后，将膦-ssDNA缀合物共价连接到叠氮化物柄上从而在叠氮基糖和DNA之间形成了酰胺键(施陶丁格连接反应，E.Saxon等人,Science2000,287)。通过合成叠氮基糖的代谢在细胞表面糖缀合物内设置的叠氮化物可以与生物素化的三芳基膦反应以产生多种稳定的细胞表面加成物。然而，共价代谢方法花费数天时间来制备用于DNA连接的细胞，并且改变细胞表面的糖对细胞有代谢上的影响，其在有机会对所述细胞进行分析之前使其改变。它还限于在表面上具有唾液酸的特定哺乳动物细胞，因此不能用于细菌、植物细胞、真菌或多种其他动物细胞。通过抗体和细胞表面上配体的非共价连接还将活化细胞并因此在可以开始分析前干扰细胞，另外，与共价连接相比，非共价连接倾向于较弱并且是“可逆的”。另外，抗体机制需要在细胞上普遍存在配体，并且需要设计对配体具有特异性的抗体从而将足够的DNA固定在细胞表面上。已制备了通过细胞表面上的配体与抗体之间相互作用的非共价连接，其中所述抗体带有结合蛋白的DNA链(BaileyRC等人,JAmChemSoc.2007Feb21；129(7):1959-67)。这两种方法均具有使得它们所要捕获用以研究的细胞活化的直接缺点，并因此在可以进行分析之前将目标事物变得不同。克服这些细胞表面上DNA连接早期系统的缺点可改变此所述新兴领域并提供先前所不可能的有价值工具和操作。
技术实现思路
在一个实施方案中，本专利技术提供了具有细胞的组合物，其中所述细胞具有包含天然官能团的表面，并且其中所述细胞没有细胞壁。所述组合物还包含核酸部分，其中所述核酸部分共价连接到所述天然官能团上。在另一个实施方案中，本专利技术提供了通过将细胞与活化的核酸部分相接触来制备所述细胞和核酸部分的缀合物的方法，其中所述细胞具有包含天然官能团的表面，并且其中所述细胞没有细胞壁，从而使得所述核酸部分共价连接到所述天然官能团上。在另一个实施方案中，本专利技术提供了具有细胞和核酸部分的组合物，其中所述细胞具有细胞壁，以及其中所述核酸部分共价连接到所述细胞。在另一个实施方案中，本专利技术提供了通过将细胞与活化的核酸部分接触来制备所述细胞和核酸部分的缀合物的方法，其中所述细胞包含细胞壁，从而使得所述核酸部分与所述细胞连接。在另一个实施方案中，本专利技术提供了包含细胞和基底表面的装置，其中所述细胞具有共价连接到第一核酸部分的天然官能团的细胞表面，所述基底表面具有与所述第一核酸部分互补的第二核酸部分，使得所述细胞通过形成第一和第二核酸部分的核酸双链体从而与所述基底表面结合。附图说明图1.ssDNA与细胞表面的共价连接。(a)首先，在室温下将巯基化单链DNA与PBS中的NHS-PEG-马来酰亚胺反应以形成NHS-DNA缀合物。然后，在室温下将该溶液与PBS中的活细胞悬液一起孵育30分钟。连接DNA链之后，将细胞放回到培养基中。(b，c)将Jurkat细胞暴露于(a)中所述的不同浓度的NHS-DNA溶液。然后，加入荧光互补链，并使用流式细胞术对细胞修饰水平定量。在每个细胞上可以装载多达120000条DNA链。(d)使表面上细胞图案化的方法的示意图。图2.以DNA序列特异性的方式固定细胞。(a)具有与DNA微阵列上的互补(序列M2)点(点尺寸＝60μm)相结合的DNA序列C2的细胞。具有非互补序列M1的相邻点保持为空。(b)将同一微阵列基底分别暴露于具有序列C2和C1的Jurkat和MDA细胞的混合悬液。用Cell-TrackerGreen对Jurkat细胞染色，并且用Cell-trackerBlue对MDA细胞染色。(c)MCF-7和(d)MDA细胞还以快速、稳定并且序列特异的方式与DNA包被的表面结合。在DNA包被和未包被区域之间观察到了清楚的界限。孵育2小时后，显示了相差图像。(e)MCF-7和(f)MDA细胞在36小时后铺展并增殖，但它们仍被约束在DNA印制区域内。图3.原代细胞的直接DNA修饰和捕获。(a)人红细胞以与Jurkat细胞相同的方式结合在DNA点上，并且它们在刚结合后看上去在形态上是相同的。台盼蓝染色表明膜保持完整。(b)DNA包被的小鼠CD4+辅助T细胞与包被了互补DNA的点结合。暴露3分钟后，在载玻片的印制和未印制区域之间可以观察到清楚的边界。(c)通过光刻法和微制造(microfabrication)制备了微尺度的DNA图案。与荧光素缀合的ssDNA链在基底上形成图案以允许观察。(d)在相同DNA图案上捕获了小鼠原本文档来自技高网...

【技术保护点】
组合物，其包含：细胞，其中所述细胞具有包含天然官能团的表面，并且其中所述细胞没有细胞壁；和核酸部分，其中所述核酸部分与所述天然官能团共价连接。

【技术特征摘要】
2009.04.08 US 61/167,748;2009.09.16 US 61/243,1231.组合物，其包含：细胞，其中所述细胞具有包含天然官能团的表面，并且其中所述细胞没有细胞壁；和核酸部分，其中所述核酸部分与所述天然官能团共价连接。2.根据权利要求1的组合物，其中所述细胞是原代细胞。3.根据权利要求1的组合物，其中所述细胞是哺乳动物细胞。4.根据权利要求1的组合物，其中所述细胞是干细胞。5.根据权利要求1的组合物，其中所述天然官能团包含选自下列的氨基酸：赖氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和色氨酸。6.根据权利要求1的组合物，其中所述天然官能团包含赖氨酸。7.根据权利要求1的组合物，其中所述核酸部分包含选自下列的组分：寡核苷酸、DNA、RNA、PNA和适体。8.根据权利要求1的组合物，其中所述核酸部分包含单链DNA。9.根据权利要求1的组合物，其中所述核酸部分包含约10至约200个核酸。10.根据权利要求1的组合物，其中所述核酸部分包含适体。11.根据权利要求1的组合物，其中所述核酸部分包含接头。12.根据权利要求1的组合物，其包含哺乳动物细胞，其在细胞表面上包含赖氨酸；和单链脱氧核酸，其通过酰胺与所述赖氨酸共价连接。13.制备细胞和核酸部分的缀合物的方法，其包括：将所述细胞与活化的核酸部分相接触，其中所述细胞具有包含天然官能团的表面，并且其中所述细胞没有细胞壁，使得所述核酸部分与所述天然官能团共价连接。14.根据权利要求13的方法，其中所述活化的核酸部分包含活化的酯。15.根据权利要求13的方法，其包括：将哺乳动物细胞与活化的核酸部分相接触，其中所述天然官能团包含赖氨酸，并且所述活化的核酸部分包含NHS-酯，使得所述核酸部分通过形成酰胺键与所...

【专利技术属性】
技术研发人员：萧世嘉，马修·B·弗朗西斯，卡罗伦·贝尔托齐，理查德·马蒂斯，拉维·钱德拉，埃里克·道格拉斯，艾米·特威特，尼古拉斯·托列洛，尾上弘晃，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国,US