使用病毒的基因编辑方法技术

提供了一种将多核苷酸序列插入细胞的基因组中的方法。所述方法包括：在所述基因组的靶位点产生双链断裂；和向所述细胞引入病毒。所述病毒包含含有待插入的所述多核苷酸序列或其互补序列的核酸。所述核酸不包含与所述靶位点对应的同源臂或包含与所述靶位点对应的非常短(5～25bp)的同源臂。本申请还提供了一种用于将多核苷酸序列插入细胞的基因组中的组合物。所述组合物包含能够在基因组的靶位点产生DNA双链断裂的位点特异性核酸酶和病毒，所述病毒包含含有所述多核苷酸序列或其互补序列的核酸。

Gene editing using viruses

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用病毒的基因编辑方法相关申请的交叉引用本申请要求2016年12月29日提交的美国临时专利申请号62/439,897的优先权，其公开内容通过引用并入本申请。专利
本专利技术一般地涉及使用病毒进行基因编辑的方法。
技术介绍
使用经工程化改造的位点特异性核酸酶(例如，CRISPR、ZFN、TALEN)的基因编辑技术的开发为在包括人在内的高等生物中进行靶向基因修饰打开了大门，并且具有基因治疗的巨大潜力。这种基因编辑技术通常依赖于核酸酶以形成DNA双链断裂(DSB)以及细胞DNA修复机制以产生靶向突变或基因插入(即，敲入)。精确的位点特异性基因插入通常通过同源定向修复(HDR)途径发生，即使在存在DSB的情况下，其也具有较低的重组率。而且，HDR需要供体模板以包括与DSB的翼侧序列同源的序列(同源臂)。病毒已被广泛用于递送外源性核酸，因此可以将其用于递送用于基因编辑的核酸试剂。然而，就核酸尺寸而言，所有病毒均具有有限的包装能力。由于基于HDR的基因编辑需要含有同源臂的供体模板，因而限制了插入片段的尺寸。例如，腺相关病毒(AAV)(一种常用的基因递送病毒)仅具有长度为～4.7kb的基因组，这使得插入长序列是不切实际的。因而，对开发使用病毒的新基因编辑技术存在持续的需求。
技术实现思路
在一个方面中，本公开内容提供了一种将多核苷酸序列插入细胞的基因组的方法。在一个实施方式中，所述方法包括：在所述基因组的靶位置产生DNA双链断裂；和向所述细胞引入病毒，其中所述病毒包含核酸，所述核酸含有所述多核苷酸序列或其互补序列，其中所述核酸不包含与所述靶位置对应的同源臂。在另一个方面中，本公开内容提供了一种用于将多核苷酸序列插入细胞的基因组的组合物。在一个实施方式中，所述组合物包含：能够在所述基因组的靶位置产生DNA双链断裂的位点特异性核酸酶；和病毒，所述病毒包含核酸，所述核酸含有所述多核苷酸序列或其互补序列，其中所述核酸不包含与所述靶位置对应的同源臂。在某个实施方式中，根据所述靶位置，所述核酸包含微同源臂(5-25bp)。在某些实施方式中，所述病毒是双链DNA(dsDNA)病毒或在病毒生命周期中具有dsDNA中间体的病毒。所述病毒可以是腺相关病毒、逆转录病毒、疱疹病毒或慢病毒。在某些实施方式中，所述核酸是单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、单链RNA(ssRNA)或双链RNA(dsRNA)。在某些实施方式中，所述多核苷酸序列编码B-结构域缺失的因子VIII(BDD-F8)。在某些实施方式中，所述多核苷酸序列包含2A序列。在某些实施方式中，所述多核苷酸序列可以编码多个多肽。编码多个多肽的序列可以是通过2A或IRES序列连接的多顺反子。在某些实施方式中，所述多核苷酸序列在其5’末端包含信号肽编码序列。在某些实施方式中，所述双链断裂是通过向所述细胞引入包含位点特异性核酸酶的组合物产生的。在某些实施方式中，位点特异性核酸酶是CRISPR相关(Cas)核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或锌指核酸酶(ZFN)。在某些实施方式中，所述组合物还包含导向至所述靶位置的CRISPR-Cas向导RNA。在某些实施方式中，所述位点特异性核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)，或TALE-核酸酶(TALEN)。在CRISPR/Cas系统中，所述双链断裂是由Cas向导RNA定向的CRISPR核酸酶产生的，所述Cas向导RNA根据所述靶位置的序列设计。在某些实施方式中，所述靶位置可以是基因组的任何基因座，包括编码和非编码区以及安全港基因座，如例如Hipp11(H11)基因座、ROSA26基因座、Rosa26样基因座(LLC)、HPRT或AAVS1。在某些实施方式中，所述细胞是真核细胞，例如哺乳动物或人细胞。在某些实施方式中，所述细胞是体外的、离体的或体内的。在某些实施方式中，所述细胞是单细胞胚胎。附图说明图1A-1C显示了使用表达Cas9和靶向GAPDH基因3’末端的gRNA的AVV以及包含下述的供体AAV病毒感染的HEK293细胞的GFP信号：(1)在每个末端具有1kb同源臂的IRES-GFP(图1A)；(2)在每个末端具有0.2kb同源臂的IRES-GFP(图1B)；(3)在每个末端没有臂而是gRNA靶向序列的IRES-GFP(图1C)。上栏显示了供体病毒构建的示意图。中栏显示了GFP信号图像，和下栏是明场图像。图2示出了通过FACS测定的上述处理的HEK293细胞。Y轴：PI染色强度。X轴：GFP信号强度。图3示出了使用表达来自金黄色葡萄球菌的Cas9(SaCas9)核酸酶和gRNA的AAV和不具有同源臂的供体AAV病毒通过NHEJ在ALB基因座敲入BDDF8的示意图。gRNA靶向位点位于人白蛋白基因的最后一个编码外显子上游的内含子中。供体载体编码BDDF8，其前面是2A肽编码序列，最后一个编码外显子的13个氨基酸的编码序列和转录剪接信号(SA)。将插入序列侧翼的两个gRNA识别序列克隆到载体中。在Cas9/gRNA与供体病毒共转染后，Cas9/gRNA将靶向基因组位点并切割双链供体病毒中间体。线性化的供体DNA将通过NHEJ插入基因组位点。一半的整合将导致ALB和BDD-F8在DNA和RNA水平的融合，但是由于在翻译过程中的核糖体跳跃，ALB和BDD-F8作为两种单独的蛋白产生。图4A-4B表示在小鼠肝细胞中的Alb基因座BDD-F8转基因敲入的RT-PCR和测序分析。图4A显示了融合的小鼠AlbmRNA的示意图，其在Alb外显子13和外显子14之间具有BDD-F8转基因整合。箭头组表示用于RT-PCR和测序分析的引物。图4B显示了使用所示引物的RT-PCR分析。每个泳道均代表一个单独小鼠的肝脏RNA样品。值的注意的是，在接受2x1013gc/kgAAV8病毒的两只小鼠中，如根据两个独立的具有预期分子量(通过引物ex13-F1和BDD-F8-R1扩增的产物为393bp，和通过引物ex13-F2和BDD-F8-R2扩增的产物为171bp)的PCR产物判断的，在肝细胞中可见BDD-F8转基因至Alb基因座的敲入事件。图5显示了在血友病小鼠模型中F8敲入恢复了凝血。结果表明F8KO与载剂相比或WT与载剂相比*P<0.05，每组n＝3-5只小鼠。图6A-6C显示了在血友病小鼠模型中F8敲入减少出血。图6A上栏显示了在注射渐增病毒剂量的血友病小鼠中前30min内的尾部出血情况，每4min取样一次。图6B显示了前30min内的总失血情况。结果表明F8KO与载剂相比*P<0.05，**P<0.01，WT与载剂相比#P>0.2，每组n＝3-5只小鼠。图6C显示了前30分钟内的平均终点出血速度。结果表明F8KO与载剂相比*P<0.05，**P<0.01，WT与载剂相比#P>0.3，每组n＝3-5只小鼠。专利技术详述我们已开发了将多核苷酸序列插入细胞的基因组的方法和组合物。在一个方面中，所述方法包括在基因组的靶位点产生双链断裂和向细胞引入病毒。病毒包含核酸，所述核酸含有待插入的多核苷酸序列或其互补序列。所述核酸不包含与靶位点对应的同源臂。在某些实施方式中，所述核酸包含与靶位点对应的非常短(5～25bp)的微同本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种将多核苷酸序列插入细胞的基因组的方法，所述方法包括：在所述基因组的靶位置产生DNA双链断裂；和向所述细胞引入病毒，其中所述病毒包含核酸，所述核酸含有所述多核苷酸序列或其互补序列，其中所述核酸不包含与所述靶位点对应的同源臂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.29 US 62/439,8971.一种将多核苷酸序列插入细胞的基因组的方法，所述方法包括：在所述基因组的靶位置产生DNA双链断裂；和向所述细胞引入病毒，其中所述病毒包含核酸，所述核酸含有所述多核苷酸序列或其互补序列，其中所述核酸不包含与所述靶位点对应的同源臂。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸包含微同源臂。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒是双链DNA(dsDNA)病毒或在病毒生命周期中具有dsDNA中间体的病毒。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒是腺相关病毒、逆转录病毒或慢病毒。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸是单链DNA(ssDNA)或双链DNA(dsDNA)。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸序列编码B结构域缺失的因子VIII。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述双链断裂是通过向所述细胞引入包含位点特异性核酸酶的组合物产生的。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述位点特异性核酸酶是CRISPR相关(Cas)核酸酶。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述组合物还包含导向至所述靶位点的CRISPR-Cas向导RNA。10.根据权利要求7所述的方法，其中所述位点特异性核酸酶是转录激活因子样效应物核酸酶或锌...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔令洁，M·施，H·陈，R·雁如·蔡，
申请(专利权)人：应用干细胞有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US