具有提高的敲入效率的基因编辑方法技术

本公开内容提供了使用具有3’悬突的单链DNA或双链DNA在细胞的基因组中靶向插入目标基因的组合物和方法。还提供了产生能够用于靶向插入的具有3’悬突的单链DNA或双链DNA的方法。

Gene editing with improved typing efficiency

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有提高的敲入效率的基因编辑方法相关申请的交叉引用本申请要求2017年06月16日提交的美国临时专利申请号62/521,280的优先权，其公开内容通过引用并入本申请。专利
本专利技术一般地涉及基因编辑的方法。
技术介绍
使用经工程化改造的位点特异性核酸酶(例如，CRISPR、ZFN、TALEN)的基因编辑技术的开发为在包括人在内的高等生物中进行靶向基因修饰打开了大门，并且具有基因治疗的巨大潜力。这种基因编辑技术通常依赖于核酸酶以形成DNA双链断裂(DSB)以及细胞DNA修复机制以产生靶向突变或基因插入(即，敲入)。目标基因的精确位点特异性插入通常通过同源定向修复(HDR)途径发生，即使在存在DSB的情况下，其也具有较低的重组率。据报道，使用单链DNA(ssDNA)提供目标基因供体能够提高通过HDR靶向插入的效率(参见例如，Quadros等人，“Easi-CRISPR:arobustmethodforone-stepgenerationofmicecarryingconditionalandinsertionallelesusinglongssDNAdonorsandCRISPRribonucleoproteins.”GenomeBiology(2017)18:92)。然而，长的ssDNA是不稳定的，并且通过化学合成产生的ssDNA的尺寸限制在约200个核苷酸。因此，对开发具有提高的插入效率的新基因编辑技术存在持续的需求。
技术实现思路
在一个方面中，本公开内容提供了一种用于编辑细胞中的靶基因座的组合物。在一个实施方式中，所述组合物包含(i)位点特异性核酸酶或编码其的核酸；和(ii)单链DNA(ssDNA)，所述ssDNA包含侧翼为与所述靶基因座互补的同源臂的目标基因，其中所述ssDNA具有核酸外切酶抗性修饰。在某些实施方式中，所述位点特异性核酸酶是Cas9、锌指核酸酶或TALEN。在某些实施方式中，所述位点特异性核酸酶是Cas9，并且所述组合物还包含导向至所述靶基因座的向导RNA。在某些实施方式中，所述核酸外切酶抗性修饰是生物素化、5’羟基、硫代磷酸酯键、2’-O-甲基碱基或2’氟碱基。在某些实施方式中，所述核酸外切酶抗性修饰对λ核酸外切酶、T5核酸外切酶或T7核酸外切酶具有抗性。在另一个实施方式中，本申请提供的组合物包含(i)位点特异性核酸酶或编码其的核酸；和(ii)双链DNA(dsDNA)，所述dsDNA由第一DNA链和第二DNA链组成，其中所述dsDNA包含侧翼为与所述靶基因座互补的同源臂的目标基因，其中所述第一DNA链具有在3’末端的第一单链DNA(ssDNA)悬突，并且所述第二DNA链具有在3’末端的第二ssDNA悬突。在某些实施方式中，所述第一和第二DNA链中的每一个均具有核酸外切酶抗性修饰。在某些实施方式中，所述核酸外切酶抗性修饰是生物素化、硫代磷酸酯键、2’-O-甲基或2’氟碱基。在某些实施方式中，所述核酸外切酶抗性修饰对λ核酸外切酶、T5核酸外切酶或T7核酸外切酶具有抗性。在某些实施方式中，所述第一和第二ssDNA悬突中的每一个均具有5-200个核苷酸的长度。在另一个方面中，本公开内容提供了一种用于向细胞中的靶基因座插入目标基因的方法。在某些实施方式中，所述方法包括将下述引入细胞：(i)位点特异性核酸酶或编码其的核酸；和(ii)单链DNA(ssDNA)，所述ssDNA包含侧翼为与所述靶基因座互补的同源臂的目标基因，其中所述ssDNA具有一种或多种核酸外切酶抗性修饰。在另一个实施方式中，所述方法包括将下述引入细胞：(i)位点特异性核酸酶或编码其的核酸；和(ii)双链DNA(dsDNA)，所述dsDNA由第一DNA链和第二DNA链组成，其中所述第一DNA链具有在3’末端的第一单链DNA(ssDNA)悬突，并且所述第二DNA链具有在3’末端的第二ssDNA悬突。在又一个方面中，本公开内容提供了一种用于产生在本申请提供的方法中使用的ssDNA的方法。在某些实施方式中，所述方法包括：(1)使用引物对扩增所述目标基因以产生dsDNA扩增子，其中所述引物对中的一个具有对核酸外切酶具有抗性的核酸外切酶抗性修饰；和(2)使用所述核酸外切酶处理所述dsDNA扩增子，从而产生包含所述目标基因的ssDNA。在某些实施方式中，所述核酸外切酶是λ核酸外切酶、T5核酸外切酶或T7核酸外切酶。在某些实施方式中，所述核酸外切酶抗性修饰是生物素化、5’羟基、硫代磷酸酯键、2’-O-甲基或2’氟碱基。在某些实施方式中，所述ssDNA还包含位于目标基因侧翼的同源臂。在另一个方面中，本公开内容提供了一种用于产生能够用于本申请提供的方法中的具有3’单链悬突的双链DNA的方法。在某些实施方式中，所述方法包括：(1)使用引物对扩增目标基因以产生dsDNA扩增子，其中所述引物对中的每一个均具有对核酸外切酶具有抗性的核酸外切酶抗性修饰；和(2)使用所述核酸外切酶处理所述dsDNA扩增子，从而产生dsDNA，所述dsDNA由第一DNA链和第二DNA链组成，其中所述dsDNA包含所述目标基因，其中所述第一DNA链具有在3’末端的第一ssDNA悬突，并且所述第二DNA链具有在3’末端的第二ssDNA悬突。在某些实施方式中，所述dsDNA还包含位于目标基因侧翼的同源臂。在另一个实施方式中，用于产生具有3’单链悬突的双链DNA的方法包括对第一单链DNA和第二单链DNA退火，其中所述第一和第二ssDNA中的每一个是根据本申请提供的方法产生的。附图简述并入本申请中的附图构成了说明书的一部分。连同该书面描述，附图还用于解释本专利技术的原理，并使相关领域的技术人员能够实现和使用本专利技术。图1示出了用于产生用于靶向插入的ssDNA供体的方法的示例性实例。图2示出了用于产生用于靶向插入的dsDNA供体的方法的示例性实例。图3示出了使用λ核酸外切酶产生ssDNA。使用经修饰的引物通过PCR扩增dsDNA模板。使用硫代磷酸酯修饰正向引物的前6个碱基，将反向引物的5’末端磷酸化。模板含有小鼠Oprm基因和HaloTag的短同源臂。在37℃下，使用λ核酸外切酶将纯化的PCR产物消化30分钟。泳道1：1kb标记物，泳道2：双链PCR产物，泳道3：使用λ核酸外切酶由双链PCR产物产生的单链DNA。图4示出了使用ssDNA模板产生敲入小鼠。将在图3中产生的ssDNA模板进行凝胶纯化，并与靶向小鼠Oprm基因的gRNA和Cas9蛋白一起用于单胚胎显微注射。将幼崽的基因组DNA用于通过PCR进行基因分型。凝胶电泳的结果表明，10只幼崽中的2只具有正确的敲入(1.4kbPCR片段，箭头)。左侧泳道：1kb标记物。底部350bpPCR片段来自野生型等位基因。专利技术详述本公开内容的以下描述仅旨在说明本公开内容的各种实施方式。因此，所讨论的特定修订不应被解释为对本公开内容范围的限制。对于本领域技术人员将显而易见的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于向细胞中的靶基因座插入目标基因的方法，所述方法包括：/n(a)使用引物对扩增所述目标基因以产生双链DNA(dsDNA)扩增子，其中所述引物对中的一个具有对核酸外切酶具有抗性的核酸外切酶抗性修饰；/n(b)使用所述核酸外切酶处理所述dsDNA扩增子，从而产生包含所述目标基因的单链DNA(ssDNA)；和/n(c)将下述引入所述细胞/n(c1)所述ssDNA，和/n(c2)位点特异性核酸酶或编码其的核酸。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170616 US 62/521,2801.一种用于向细胞中的靶基因座插入目标基因的方法，所述方法包括：
(a)使用引物对扩增所述目标基因以产生双链DNA(dsDNA)扩增子，其中所述引物对中的一个具有对核酸外切酶具有抗性的核酸外切酶抗性修饰；
(b)使用所述核酸外切酶处理所述dsDNA扩增子，从而产生包含所述目标基因的单链DNA(ssDNA)；和
(c)将下述引入所述细胞
(c1)所述ssDNA，和
(c2)位点特异性核酸酶或编码其的核酸。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述位点特异性核酸酶是Cas9、锌指核酸酶或TALEN。


3.根据权利要求1所述的方法，其中所述位点特异性核酸酶是Cas9，并且所述组合物还包含导向至所述靶基因座的向导RNA。


4.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸外切酶抗性修饰是生物素化、5’羟基、硫代磷酸酯键、2’-O-甲基碱基或2’氟碱基。


5.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸外切酶抗性修饰对λ核酸外切酶、T5核酸外切酶或T7核酸外切酶具有抗性。


6.一种用于向细胞中的靶基因座插入目标基因的方法，所述方法包括：
(a)使用引物对扩增目标基因以产生dsDNA扩增子，其中所述引物对中的每一个具有对核酸外切酶具有抗性的核酸外切酶抗性修饰；和
(b)使用所述核酸外切酶处理所述dsDNA扩增子，从而产生dsDNA，所述dsDNA包含侧翼为与所述靶基因座互补的同源臂的所述目标基因，其中所述dsDNA由第一DNA链和第二DNA链组成，其中所述第一DNA链具有第一3’-ssDNA悬突，并且所述第二DNA链具有第二3’-ssDNA悬突；和
(c)将下述引入所述细胞
(c1)所述dsDNA，和
(c2)位点特异性核酸酶或编码其的核酸。


7.根据权利要求6所述的方法，其中所述位点特异性核酸酶是Cas9、锌指核酸酶或TALEN。


8.根据权利要求6所述的方法，其中所述位点特异性核酸酶是Cas9，并且所述组合物还包含导向至所述靶基因座的向导RNA。


9.根据权利要求6所述的方法，其中所述核酸外切酶抗性修饰是生物素化、5’羟基、硫代磷酸酯键、2’-O-甲基碱基或2’氟碱基。


10.根据权利要求6所述的方法，其中所述核酸外切酶抗性修饰对λ核酸外切酶、T5核酸外切酶或T7核酸外切酶具有抗性。


11.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一和第二3’-ssDNA悬突中的每一个均具有5-200个核苷酸的长度。


12.一种用于编辑细胞中的靶基因座的组合物，所述组合物包含：
(a)位点特异性核酸酶或编码其的核酸；和
(b)ssDNA，所述ssDNA包含侧翼为与所述靶基因座互补的同源臂的目标基因，其中所述ssDNA具有核酸外切酶抗性修饰。


13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述位点特异性核酸酶是Cas9、锌指核酸酶或TALEN。


14.根据权利要求12所述的组合物，其中所述位点特异性核酸酶是Cas9，并且所述组合物还包含导向至所述靶基因座的向导RNA。


15.根据权利要求12所述的组合物，其中所述核酸外切酶抗性修饰是生物素化、5’羟基、硫代磷酸酯键、2’-O-甲基碱基或2’氟碱基。


16.根据权利要求12所述的组合物，其中所述核酸外切酶抗性修饰对λ核酸外切酶、T5核酸外切酶或T7核酸外切酶具有抗性。


17.一种用于编辑细胞中靶基因座的组合物，所述组合物包含：
(a)位点特异性核酸酶或编码其的核酸；和
(b)dsDNA，所述dsDNA包含侧翼为与所述靶基因座互补的同源臂的目标基因，其中所述dsDNA由第一DNA链和第二DNA链组成，其中所述第一DNA链具有第一3’-ssDNA悬突，并且所述第二DNA链具有第二3’-ssDNA悬突。


18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述位点特异性核酸酶是Cas9、锌指核酸酶或TALEN。


19.根据权利要求17所述的组合物，其中所述位点特异性核酸酶是Cas9，并且所述组合物还包含导向至所述靶基因座的向导RNA。


20.根据权利要求17所述的组合物，其中所述第一和第二DNA链中的每一个均具有核酸外切酶抗性修饰。


21.根据权利要求17所述的组合物，其中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔令洁，A·法鲁吉奥，A·希尔默，P·图马拉，J·罗，R·雁如·蔡，
申请(专利权)人：应用干细胞有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US