点突变的基因型检测的方法及其试剂盒技术

本发明专利技术提供一种点突变的基因型检测的方法及其试剂盒，所述试剂盒是利用荧光定量PCR的荧光探针熔解曲线直接进行点突变的基因型检测；所述试剂盒包括针对待检测样本的每个点突变位点进行不对称PCR扩增的一对上下游引物、针对待检测样本的每个点突变位点设计的一条Taqman探针和针对待检测样本的每个点突变位点的阳性质控品。本发明专利技术的点突变的基因型检测使用方便，便于推广使用。

Point mutation method of genotyping and its kit

The present invention provides a method for detecting gene mutation type and kit, the kit is a fluorescent probe melting curve using fluorescence quantitative PCR direct point mutation genotype detection; the kit includes a needle to detect each sample point mutation of a pair of asymmetric PCR amplification primers for each point, the detection sample mutation design a Taqman probe and needle treat detection of each sample point mutation positive quality control. The gene type detection of the point mutation of the invention is convenient and convenient to be popularized.

【技术实现步骤摘要】
点突变的基因型检测的方法及其试剂盒
本专利技术涉及分子生物学
，特别涉及一种利用荧光定量PCR的荧光探针熔解曲线直接进行点突变的基因型检测的方法及其试剂盒。
技术介绍
威尔森氏症是一种严重影响人类生活质量的疾病，它是一种因为ATP7B基因突变而导致体内铜代谢缺陷的遗传病，其具有较高的遗传异质性，不同突变位点导致发病年龄及临床表型不尽相同。对威尔森氏症患者及其家系做ATP7B的基因检测对治疗及早诊断该疾病有着现实意义。近年来随着测序技术的发展以及科研发现，大量的ATP7B基因的点突变被定位，威尔森氏症基因检测也随之得以快速发展。但威尔森氏症易感基因的突变位点多样化，且在不同地区或者不同种族，其突变的类型和频率存在差异。目前，通过流行病学调查数据表明，中国人群最常见的突变位点是ATP7B基因的c.2333G>T与c.2975C>T两个突变位点，这两个位点的突变占所有突变的比例高达51％左右，另外c.3809A>G与c.2755C>G这两个位点也是我国威尔森氏症患者中的高频位点(各自的发病率都大于1.5％)，由此可见，对这些威尔森氏症的易感位点及早进行检测具有本文档来自技高网...

【技术保护点】
点突变的基因型检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是利用荧光定量PCR的荧光探针熔解曲线直接进行点突变的基因型检测；和所述试剂盒包括：针对待检测样本的每个点突变位点进行不对称PCR扩增的一对上下游引物，所述上下游引物用于扩增含有待测点突变位点的检测序列，所述上下游引物自身不包含待检测的点突变位点，而只是使含有所述点突变位点的检测序列得到扩增；针对待检测样本的每个点突变位点设计的一条Taqman探针，所述探针的5’末端进行荧光报告基团标记，3’末端进行荧光猝灭基团标记，所述探针在所述点突变位点的位置只与所述点突变位点的野生型模板或者突变型模板中的一种完全匹配，与另外一种形成碱基错配，当它分别与野...

【技术特征摘要】
1.点突变的基因型检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是利用荧光定量PCR的荧光探针熔解曲线直接进行点突变的基因型检测；和所述试剂盒包括：针对待检测样本的每个点突变位点进行不对称PCR扩增的一对上下游引物，所述上下游引物用于扩增含有待测点突变位点的检测序列，所述上下游引物自身不包含待检测的点突变位点，而只是使含有所述点突变位点的检测序列得到扩增；针对待检测样本的每个点突变位点设计的一条Taqman探针，所述探针的5’末端进行荧光报告基团标记，3’末端进行荧光猝灭基团标记，所述探针在所述点突变位点的位置只与所述点突变位点的野生型模板或者突变型模板中的一种完全匹配，与另外一种形成碱基错配，当它分别与野生型或者突变型的检测序列相结合时，有不同的Tm值；和针对待检测样本的每个点突变位点的阳性质控品，所述阳性质控品是所述点突变位点的野生型标准质粒与突变型标准质粒。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述点突变位点的野生型标准质粒与突变型标准质粒是将针对每个点突变位点分别PCR扩增出野生型的片段及突变型的片段后分别插入到相同质粒载体中进行构建；并且所述野生型的片段和突变型的片段的长度都长于所述检测序列的长度。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：根据待检测样本的每个点突变位点的实验Tm值TmE与出现的熔解曲线峰的个数，以及相应点突变位点的阳性质控品的野生型Tm值TmP1和突变型Tm值TmP2，进行每个点突变位点的基因型的判读：a.若出现单峰，且TmP1-0.5℃≤TmE≤TmP1+0.5℃，判定为野生型；若TmP2-0.5℃≤TmE≤TmP2+0.5℃，判定为纯合突变型；b.若出现双峰，且两个峰各自在TmP1-0.5℃≤TmE≤TmP1+0.5℃与TmP2-0.5℃≤TmE≤TmP2+0.5℃范围内，判定为杂合突变型。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于扩增所述PCR反应内参的上下游引物和相应的反应内参检测探针；和/或所述PCR反应的阴性对照。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是用于检测威尔森氏综合症相关基因ATP7B的c.2333G>T、c.3809A>G、c.2975C>T与c.2755C>G四个点突变位点的试剂盒。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：检测c.2333G>T点突变位点的上下游引物和探针分别是SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:9；检测c.3809A>G点突变位点的上下游引物和探针分别是SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王华贵，赵相胜，刘利成，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：北京宏微特斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11