阿司匹林抵抗用药指导相关基因多态位点的试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术提供阿司匹林抵抗用药指导相关基因多态位点的试剂盒及其使用方法，该试剂盒是利用封闭型荧光探针熔解曲线检测5个与阿司匹林抵抗相关的靶标，包含PEAR1基因的位点rs12041331、GP1BA基因的位点rs6065、PTGS1基因的位点rs10306114、ITGB3基因的位点rs5918和LTC4S基因的位点rs730012。本发明专利技术单管反应管中能检测五个靶标，存在10条引物和5条封闭型检测探针，且同时能够有效区分杂合基因型，在本发明专利技术设计引物和酶切探针中，实现了每种靶点之间检测不互相干扰，并且实现了与单重检测相同的检测灵敏度和特异性。相同的检测灵敏度和特异性。相同的检测灵敏度和特异性。

【技术实现步骤摘要】
阿司匹林抵抗用药指导相关基因多态位点的试剂盒及其使用方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，特别涉及阿司匹林抵抗用药指导相关基因多态位点的试剂盒及其使用方法。

技术介绍

[0002]阿司匹林是治疗急性冠状动脉综合征和经皮冠状动脉介入术后抗栓的基础药物，广泛应用于心脑血管疾病一级和二级预防，它能使心肌梗死、脑卒中和死亡的风险降低约25％。然而在临床实践中，高达40%的患者尽管长期规律服用常规剂量的阿司匹林仍不能有效抑制血小板的活性，导致血栓栓塞事件的发生，这一现象被称之为
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阿司匹林抵抗（aspirin resistance，AR）”。存在AR的患者更易出现血栓事件，死亡、心肌梗死和脑血管事件发生率是阿司匹林反应正常人群的3倍，临床预后差。
[0003]研究表明，PEAR1（rs12041331）、GP1BA（rs6065）、PTGS1（rs10306114）、ITGB3（rs5918）和LTC4S（rs730012）基因多态性在阿司匹林抵抗中起着重要作用。ITGB3是阿司匹林抵抗主要基因，该基因突变使得GPIIb/IIIa受体结构发生改变，使血小板之间发生交叉连接，导致血小板聚集。研究发现，发生阿司匹林抵抗患者携带P1A2等位基因的频率明显高于阿司匹林敏感患者，且P1A2/A2纯合突变型患者服用阿司匹林后疗效均不良。携带突变型P1A2等位基因患者行支架术后，其亚急性血栓事件发生率是P1A1纯合野生型患者的5倍，需要更高剂量的阿司匹林才能达到抗凝效果。PEAR1 GG等位基因对阿司匹林应答好，AA或AG基因型患者支架植入术后服用阿司匹林（或结合氯吡格雷），其心肌梗死和死亡率高。PTGS1 GG基因型，阿司匹林抵抗风险高（HR：10），心血管事件发生率高（HR：2.55）；AG基因型风险中等，应密切关注阿司匹林治疗效果；AA基因型阿司匹林较敏感，心血管事件发生率较低。血小板主要抗体GP1BA 的变异有可能使得机体易产生相应的抗体，也可能使得血小板激活增加。除此之外，与阿司匹林不良反应相关的基因位点LTC4S，是半胱酰白三烯合成通路中一个重要的酶，半胱酰白三烯是很强的炎症介质，LTC4S 基因中的 AA 基因型，使用阿司匹林发生荨麻疹的风险较 AC 和 CC 型低，突变患者应注意药源性皮疹的发生。因此，对阿司匹林抵抗相关基因进行基因型检测有助于阿司匹林的个体化用药。
[0004]目前关于阿司匹林抵抗基因检测的方法主要有PCR
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Sanger测序法、芯片法、荧光定量PCR等。CN104928398A、CN104975016A和CN 109207583A采用一代测序，虽然是检测的金标准，但对试剂和仪器有特殊要求，整个检测过程涉及PCR
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电泳
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测序
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测序结果的解读等一系列步骤，费时费力，严重制约其在临床中的应用；CN114525337B采用基因芯片法，灵敏度仅能达到104copies/ml，且操作过程容易造成交叉污染导致假阳性；CN111154842A专利整体使用MGB探针，采用了4种不同的探针，实现一管试剂同时检测两个SNP位点，整个4个SNP使用两管试剂，结果读取过程需要依赖扩增曲线和CT值来判别基因型。CN109486943A对7个SNP进行检测，据荧光扩增曲线即可完成结果判读，避免了复杂的计算，但需要7个单管才可完成检测。CN109055530A利用ARMS
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PCR引物的3 '端末位碱基必须与其模板DNA互补才
能有效扩增的原理，突变位点位于引物 3
’
端，只有引物3
’
末端完全配对时，才能正常扩增，当引物 3
’
末端发生错配时，不能有效的扩增。比较容易设计优化，但该方法存在一定缺陷，其一，检测通量低，完成一个样本检测需分别设置两管PCR反应液，一管对野生型模板进行扩增和检测，另一管对突变型模板进行扩增和检测；其二，结果判读不直观，需根据
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CT对结果进行判断，临床推广受限；其三，不能完全消除非特异性扩增。
[0005]因此，开发一种可以对多个阿司匹林抵抗用药指导相关基因位点同时进行检测，判断直观，综合评价更加全面的多重检测试剂盒尤为重要。

技术实现思路

[0006]为了解决上述问题，本申请人基于先前开发的利用荧光探针熔解曲线检测待测目标核酸序列的方法(专利号202111237062.0) 开发了阿司匹林抵抗用药指导相关基因多态位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是利用封闭型荧光探针熔解曲线检测5个与阿司匹林抵抗相关的靶标，包含 PEAR1基因的位点rs12041331、GP1BA基因的位点rs6065、PTGS1基因的位点rs10306114、ITGB3基因的位点rs5918和LTC4S基因的位点rs730012；针对每个待测位点设计特异性上、下游引物和探针，实现对每个待测目标核酸序列的扩增产物与探针结合片段的熔点Tm值的控制，使得同一荧光标记通道内不同的待测目标核酸序列的扩增产物与探针结合形成片段的熔点Tm值有差异，且该差异可被检测仪器所区分；所述探针含至少一个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5
’
端一侧末端碱基及非末端探针碱基上分别标记猝灭基团，在所述RNA碱基右侧靠近所述探针3
’
端一侧的非末端碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3
’
端一侧的末端碱基上连接封闭基团，在所述RNA碱基右侧相隔至少一个碱基后连接至少3个连续的硫代磷酸化修饰碱基，所述硫代磷酸化修饰碱基位于所述荧光基团左侧，所述RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值低于在所述RNA碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值；通过不同位点的PCR产物与所述RNA碱基右侧的含有荧光基团的结合片段的Tm差异和/或不同的荧光标记，实现多个待测位点的多重检测和待测位点中的SNP的检测；一管多重核酸反应液包括以下引物和探针，其中*为硫代磷酸化修饰，小写字母碱基为RNA碱基，加粗碱基标记荧光基团，斜体碱基连接猝灭基团：
。
[0007]在一种实施方式中，所述一管多重核酸反应液还包括内参引物和探针：。
[0008]在一种实施方式中，所述试剂盒还包括PEAR1基因rs12041331位点野生型和突变型质粒、GP1BA基因rs6065位点野生型和突变型质粒、PTGS1基因rs10306114位点野生型和突变型质粒、ITGB3基因rs5918位点野生型和突变型质粒、LTC4S基因rs730012 位点野生型和突变型质粒；它们各自作为各自位点的对照。
[0009]在一种实施方式中，单反应管中的五条探针，共标记三种荧光基团。
[0010]在一种实施方式中，rs12041331和rs6065位点的探针标记第一种荧光基团， rs10306114和rs5918位点的探针标记第二种荧光基团，和rs730012位点的探针标记第三种荧光基团。
[0011]在一种实施本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.阿司匹林抵抗用药指导相关基因多态位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是利用封闭型荧光探针熔解曲线检测5个与阿司匹林抵抗相关的靶标，包含 PEAR1基因的位点rs12041331、GP1BA基因的位点rs6065、PTGS1基因的位点rs10306114、ITGB3基因的位点rs5918和LTC4S基因的位点rs730012；针对每个待测位点设计特异性上、下游引物和探针，实现对每个待测目标核酸序列的扩增产物与探针结合片段的熔点Tm值的控制，使得同一荧光标记通道内不同的待测目标核酸序列的扩增产物与探针结合形成片段的熔点Tm值有差异，且该差异可被检测仪器所区分；所述探针含至少一个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5
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端一侧末端碱基及非末端探针碱基上分别标记猝灭基团，在所述RNA碱基右侧靠近所述探针3
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端一侧的非末端碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3
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端一侧的末端碱基上连接封闭基团，在所述RNA碱基右侧相隔至少一个碱基后连接至少3个连续的硫代磷酸化修饰碱基，所述硫代磷酸化修饰碱基位于所述荧光基团左侧，所述RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值低于在所述RNA碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值；通过不同位点的PCR产物与所述RNA碱基右侧的含有荧光基团的结合片段的Tm差异和/或不同的荧光标记，实现多个待测位点的多重检测和待测位点中的SNP的检测；一管多重核酸反应液包括以下引物和探针，其中*为硫代磷酸化修饰，小写字母碱基为RNA碱基，加粗碱基标记荧光基团，斜体碱基连接猝灭基团：。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述一管多重核酸反应液还包括内参引物和探针：。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PEAR1基因rs12041331位点野生型和突变型质粒、GP1BA基因rs6065位点野生型...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜君，赵梦娜，唐奇，王华贵，陈璐，
申请(专利权)人：北京宏微特斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：