一种三种人源绦虫ep45基因的通用引物、核苷酸序列及其鉴别方法技术

本发明专利技术涉及分子生物技术领域，公开了一种三种人源绦虫ep45基因的通用引物、核苷酸序列及其鉴别方法。该引物包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物；其中，SEQ ID NO:1：5’‑AGAGACAAAGGAAAGGCAGCTG‑3’；SEQ ID NO:2：5’‑GGGGCTCAGGCACCTTGAT‑3’；本发明专利技术的实施方式通过设计三种人源绦虫ep45基因的通用引物，RT‑PCR扩增获取绦虫的ep45基因片段，然后根据三者ep45之间限制性内切酶位点的差异，用EcoR I和/或Aar I进行酶切处理，根据酶切产物电泳出现图谱的差异(1条/2条/3条带)对三种人源绦虫进行种间鉴定，大大缩短了PCR产物测序鉴定的时间，而且根据酶切图谱的判定结果更准确、可靠。

A universal primer, nucleotide sequence and identification method of Ep45 gene of three species of Taenia solium

The present invention relates to the field of molecular biotechnology, and discloses a universal primer, nucleotide sequence and identification method for Ep45 gene of three kinds of human tapeworm. The primers include downstream primers such as SEQ ID NO:1 shown upstream primers and SEQ ID NO:2 shown; among them, SEQ ID NO:1:5 AGAGACAAAGGAAAGGCAGCTG '3' SEQ ID NO:2:5 '; GGGGCTCAGGCACCTTGAT; \3 embodiments of the present invention by universal primers designed three kinds of people the source of tapeworms Ep45 gene, Ep45 RT gene fragment was amplified by PCR from acquisition based on the difference between the three, then the Ep45 restriction sites, EcoR I and / or Aar I enzyme treatment, according to the differences of digestion products electrophoresis Atlas (1 /2 /3 bands) species identification of three species of human tapeworm, greatly shorten the time PCR product sequencing, and restriction enzyme mapping according to the judgment result is more accurate and reliable.

【技术实现步骤摘要】
一种三种人源绦虫ep45基因的通用引物、核苷酸序列及其鉴别方法
本专利技术涉及分子生物领域，特别涉及一种三种人源绦虫ep45基因的通用引物、核苷酸序列及其鉴别方法。
技术介绍
猪带绦虫(Taeniasolium)、亚洲带绦虫(Taeniaasiatica)和牛带绦虫(Taeniasaginata)是重要的人兽共患寄生虫，均寄生于人的小肠内，引起人的绦虫病甚至囊虫病。因此，种类的鉴别在绦虫病/囊虫病的相关研究和综合防治中具有重要意义。由于寄生于人肠道的三种绦虫虫体形态非常相似，三者之间最主要的区别在于头节上有无顶突和小钩。因此，传统的方法都是通过头节的压片后显微镜观察加以区别。但遗憾的是排出体外的虫体常缺失头节，单纯依靠节片或虫卵很难进行鉴别，通常需进行分子生物学方法的鉴定。最常用的鉴别方法是通过PCR分别扩增三种虫体的18s或线粒体基因序列，然后进行测序分析，根据目的序列的差异进行鉴定。但该方法的缺点是测序比较费时，而且当序列相似性很接近时(杂交种)，无法进行准确的种间鉴定。
技术实现思路
本专利技术实施方式的目的在于提供一种三种人源绦虫的鉴别方法，不但克服了传统显微镜检查的缺点，而且通过通用引物进行单基因的PCR扩增和酶切鉴定，无需进行基因测序即可实现等绦虫的分子鉴定，大大加快了绦虫鉴定的速度，同时通过酶切图谱比较的方法，使得绦虫的鉴定结果更加准确、可靠。为解决上述技术问题，本专利技术的实施方式提供了一种三种人源绦虫ep45基因的通用引物，该引物包括如SEQIDNO:1所示的上游引物和SEQIDNO:2所示的下游引物；其中，SEQIDNO:1：5’-AGAGACAAAGGAAAGGCAGCTG-3’；SEQIDNO:2：5’-GGGGCTCAGGCACCTTGAT-3’。本专利技术的实施方式还提供了一种三种人源绦虫ep45的核苷酸序列，三种人源绦虫为猪带绦虫、牛带绦虫以及亚洲带绦虫；猪带绦虫的ep45的核苷酸序列参见SEQIDNO:3；牛带绦虫的ep45的核苷酸序列参见SEQIDNO:4；亚洲带绦虫的ep45的核苷酸序列参见SEQIDNO:5。本专利技术的实施方式还提供了一种三种人源绦虫的鉴别方法，该方法包括以下步骤：(1)提取三种待鉴别人源绦虫的总RNA，通过权利要求1所述的通用引物对总RNA进行反转录，合成待鉴别人源绦虫的cDNA；(2)以待鉴别人源绦虫cDNA为模板ep45基因进行PCR扩增；(3)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行胶回收；得到ep45胶回收产物；(4)使用EcoRI和/或AarI限制性内切核酸酶对ep45胶回收产物进行酶切处理；(5)对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据酶切图谱对人源绦虫进行鉴定。本专利技术实施方式相对于现有技术而言，通过设计ep45基因的通用引物，这样便可以通过RT-PCR扩增获取三种人源绦虫的ep45基因片段，然后根据三者之间限制性内切酶位点的差异，用EcoRI和/或AarI进行酶切处理，根据酶切产物电泳出现图谱的差异(1条/2条/3条带)可对人源绦虫进行种间鉴定，大大缩短了人源绦虫鉴定的时间，而且酶切图谱比序列比较的判定结果更加可靠。优选地，ep45基因PCR扩增的条件为：95℃预变性5min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸90s，共30个循环；最后一个循环结束后，72℃延伸10min。优选地，ep45基因PCR扩增的反应体系如下：rTaqmixture：25.0μL；SEQIDNO:1：1.0μL；SEQIDNO:2：1.0μL；待鉴别人源绦虫cDNA：1.0μL；DEPCH2O:22.0μL。优选地，步骤3中使用DNA凝胶进行胶回收。优选地，待鉴别人源绦虫的总RNA从绦虫节片或虫卵中提取。优选地，ep45基因的酶切体系如下：ep45胶回收产物5μL；EcoRI或/AarI1μL；Buffer2μL；去离子水11.5μL。附图说明图1是根据本专利技术第二实施方式中对胶回收产物进行单酶切的酶切图谱。1、12:TScontrol；2、11:TSAcontrol；3、10:TAScontrol；4:TSep45EcoRI酶切结果；5：TSAep45EcoRI酶切结果；6:TASep45EcoRI酶切结果；7:TSep45AarI酶切结果；8:TSAep45AarI酶切结果；9:TASep45AarI酶切结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。本专利技术的第一实施方式涉及一种三种人源绦虫ep45基因的通用引物，该引物包括如SEQIDNO:1所示的上游引物和SEQIDNO:2所示的下游引物；其中，SEQIDNO:1：5’-AGAGACAAAGGAAAGGCAGCTG-3’SEQIDNO:2：5’-GGGGCTCAGGCACCTTGAT-3’。本专利技术的第二实施方式涉及一种三种人源绦虫的鉴别方法，该方法包括以下步骤：(1)三种人源绦虫ep45的序列分析从兰州兽医研究所绦虫基因组数据库下载三种猪带绦虫(TS)、牛带绦虫(TSA)和亚洲带绦虫(TAS)的ep45基因的核苷酸序列，Blast分析比较三种绦虫的ep45的核苷酸序列，其中，猪带绦虫的ep45的核苷酸序列参见SEQIDNO:3；牛带绦虫的ep45的核苷酸序列参见SEQIDNO:4；亚洲带绦虫的ep45的核苷酸序列参见SEQIDNO:5；(2)设计三种人源绦虫ep45的通用引物用PrimerPremier5.0软件设计引物，其上游引物(ep45UPM-F)在其ORF的18-40位，下游引物(ep45UPM-R)在1305-1329位，扩增片段的长度均为1306bp，ep45UPM-F(即SEQIDNO:1):5’-AGAGACAAAGGAAAGGCAGCTG-3’；ep45UPM-R(即SEQIDNO:2):5’-GGGGCTCAGGCACCTTGAT-3’；(3)ep45基因PCR扩增收集待检人源绦虫节片或虫卵约30mg，用Trizol提取总RNA，然后用ep45UPM-R(SEQIDNO:2)为引物进行反转录，合成cDNA第一链，进而以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增的条件为：95℃预变性5min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸90s，共30个循环；最后一个循环结束后，72℃延伸10min。ep45基因PCR扩增的反应体系如下：rTaqmixture(购自TaKaRa公司)：25.0μL；SEQIDNO:1：1.0μL；SEQIDNO:2：1.0μL；待鉴别人源绦虫cDNA：1.0μL；DEPCH2O22.0μL。(4)ep45基因PCR产物的回收与纯化PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳观察，切下目的片段所在位置的胶条，用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。(5)PCR产物的酶切反应使用EcoRI和/或AarI限制性内切核酸酶对步骤4中的胶回收产物进行酶切处理；其中，酶切反应体系：需要说明的是，本实施方式使用EcoRI和/或AarI限制性内切酶的原因如下：用DNAstar-seqBuilder酶切位点软件分析三条ep45序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种三种人源绦虫ep45基因的通用引物，其特征在于，包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物；其中，SEQ ID NO:1：5’‑AGAGACAAAGGAAAGGCAGCTG‑3’；SEQ ID NO:2：5’‑GGGGCTCAGGCACCTTGAT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种三种人源绦虫ep45基因的通用引物，其特征在于，包括如SEQIDNO:1所示的上游引物和SEQIDNO:2所示的下游引物；其中，SEQIDNO:1：5’-AGAGACAAAGGAAAGGCAGCTG-3’；SEQIDNO:2：5’-GGGGCTCAGGCACCTTGAT-3’。2.三种人源绦虫ep45基因的核苷酸序列，所述绦虫为猪带绦虫、牛带绦虫以及亚洲带绦虫；其特征在于，所述猪带绦虫的ep45的核苷酸序列参见SEQIDNO:3；所述牛带绦虫的ep45的核苷酸序列参见SEQIDNO:4；所述亚洲带绦虫的ep45的核苷酸序列参见SEQIDNO:5。3.一种三种人源绦虫的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取三种待鉴别人源绦虫的总RNA，通过权利要求1所述的通用引物对总RNA进行反转录，合成待鉴别人源绦虫的cDNA；(2)以待鉴别人源绦虫cDNA为模板ep45基因进行PCR扩增；得到PCR扩增产物；(3)对所述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行胶回收；得到ep45胶回收产物；(4)使用EcoRI...

【专利技术属性】
技术研发人员：骆学农，刘光学，梁盼红，张少华，才学鹏，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62