一种猕猴桃种质资源的鉴定方法及其应用技术

本发明专利技术涉及分子鉴定技术领域，具体而言，涉及一种猕猴桃种质资源的鉴定方法及其应用，所述方法包括以下步骤：扩增待测样品的ITS2序列片段并测序；参照不同已知猕猴桃的ITS2条形码序列进行序列比对，以确定待测样品的猕猴桃种。该方法可用于猕猴桃种间的种质资源分类与鉴定。

A method for identification of Actinidia germplasm resources and its application

The invention relates to the field of molecular identification technology, in particular, relates to a method for identification of kiwifruit germplasm resources and its application, the method comprises the following steps: amplified sample ITS2 sequence fragment and sequencing; ITS2 barcode sequence according to different known kiwi in sequence alignment, to determine a sample of kiwifruit. This method can be used for classification and identification of germplasm resources among Actinidia species.

【技术实现步骤摘要】
一种猕猴桃种质资源的鉴定方法及其应用
本专利技术涉及分子鉴定
，具体而言，涉及一种猕猴桃种质资源的鉴定方法及其应用。
技术介绍
猕猴桃属(学名：Actinidia)是一种源产于亚洲东部地区的木本植物。中国东北原生种猕猴桃属植物有软枣猕猴桃[Actinidiaarguta(Sieb.etZucc.)Planch.ExMiq.]，葛枣猕猴桃[Actinidiapolygama(Sieb.etZucc.)Maxim.]及狗枣猕猴桃[Actinidiakolomikta(Rupr.&Maxim.)Maxim.]等，由于地理及气候原因，这些猕猴桃属植物都具有良好的抗寒性，是猕猴桃属植物育种研究的优良基因供体。中国农业科学院特产研究所以建立资源圃的方式保存了数百份野生猕猴桃资源，其中软枣猕猴桃资源最为丰富。近年来，软枣猕猴桃资源逐渐得到研究人员及当地农民的重视，软枣猕猴桃资源具有良好的开发前景，鉴别不同软枣猕猴桃种质资源、分析东北地区猕猴桃资源的遗传多样性具有一定的现实意义。因此有必要对东北东北野生猕猴桃资源进行分子标记技术研究。Soon-JaeKwon等和Juan-JuanLai等筛选了适合软枣猕猴桃资源研究的SSR引物并对不同软枣猕猴桃资源进行了聚类分析。H.Daietal.应用RAPD标记分析了来自9个地区的32个软枣猕猴桃资源。分析表明，软枣猕猴桃有很高的遗传多样性。但上述标记均未能很好的鉴别软枣猕猴桃种内资源，所以应考虑采用其他分子标记方法对其进行研究。DNA条形码(DNAbarcoding)是近年提出的一种分子鉴定新技术，DNA条形码技术能够利用标准的、具有足够变异、易扩增且相对较短的DNA片段实现对物种的鉴定。DNA条形码概念自2003年由加拿大分类学家PaulHebert首次提出后就在世界范围内受到了广泛关注。近几年间，DNA条形码技术逐渐成为国际生物多样性研究中的热点。2005年前后，DNA条形码概念被引入植物研究中。2009年，国际生命条形码联盟植物工作组(CBOLPlantWorkingGroup)初步确定并推荐使用叶绿体基因rbcL和matK片段。我国学者陈士林等对DNA条形码在药用植物资源中的研究进行了详细的论述，在对大量药用植物资源进行了研究基础上建议建立以ITS2为核心以trnH-psbA为辅的植物类药材DNA条形码鉴定体系。LauraJaakola等利用DNA条形码技术结合高分辨率溶解曲线(high-resolutionmelting,HRM)成功的鉴别了蓝莓品种Northcountry和Northblue，为以DNA条形码鉴别软枣猕猴桃种内不同资源的可行性提供了参考。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种猕猴桃种质资源的鉴定方法，以解决上述问题。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：本专利技术涉及一种猕猴桃种质资源的鉴定方法，包括以下步骤：扩增待测样品的ITS2序列片段并测序；参照不同已知猕猴桃的ITS2条形码序列进行序列比对，以确定待测样品的猕猴桃种。上述方法可用于猕猴桃种间(inter-species)的种质资源分类与鉴定。如上所述的方法在猕猴桃种质资源分类中的应用。猕猴桃种质材料和新品种的鉴定是猕猴桃种质资源研究利用和新品种保护的基础，由于大量猕猴桃种质资源间存在形态相似性，所以以形态学为基础的鉴定方法对非专业人员有较大的困难，DNA条形码技术因其鉴定准确、操作简单，是较为理想的鉴定方法。目前对DNA条形码的研究利用主要集中于物种鉴定方面，以条形码技术鉴定同一物种内不同个体的报道较为罕见。本专利技术利用DNA条形码对中国东北地区3个猕猴桃种共180份样品进行遗传多样性分析。其中重点分析了DNA条形码鉴别软枣猕猴桃种质资源及品种的可行性；同时比较了不同条形码及其组合在三个猕猴桃种间的遗传距离。以期探究DNA条形码在猕猴桃属植物鉴定中的进一步应用。在种内资源鉴定方面，由于软枣猕猴桃种内资源间遗传差异较小，因此各条形码片段及片段组合均不能成功鉴别不同资源及品种，但是此条形码片段具有种的特异性。在种间遗传多样性分析方面及条形码筛选比较方面，不同猕猴桃种间有明显的差异，ITS2、rbcL等序列均能成功进行不同物种的鉴别。ITS序列测序成功率较低，不适合作为猕猴桃资源的条形码序列。WilcoxonSignedRankTests检验表明核基因ITS2序列种间变异显著高于叶绿体条形码片段，而且核基因组作为鉴定植物残骸时有较好的种的特异性。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为不同条形码片段的遗传距离比较。具体实施方式本专利技术涉及一种猕猴桃种质资源的鉴定方法，包括以下步骤：扩增待测样品的ITS2序列片段并测序；参照不同已知猕猴桃的ITS2条形码序列进行序列比对，以确定待测样品的猕猴桃种。优选的，如上所述的猕猴桃种质资源的鉴定方法，扩增待测样品的ITS2序列片段时所用的引物对的核苷酸序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。优选的，如上所述的猕猴桃种质资源的鉴定方法，扩增待测样品的ITS2序列片段时的退火温度为53℃～55℃；更优选的，退火温度为54℃。优选的，如上所述的猕猴桃种质资源的鉴定方法，扩增待测样品的ITS2序列片段时的反应程序为：更优选的，反应程序为：优选的，如上所述的猕猴桃种质资源的鉴定方法，扩增待测样品的ITS2序列片段时，在PCR反应体系中：DNA模板的浓度≥1.0ng/μL，正反向引物的浓度≥0.01μmol/L；更优选的，DNA模板的浓度为1.0～1.5ng/μL，正反向引物的浓度为0.01～0.03μmol/L。优选的，如上所述的猕猴桃种质资源的鉴定方法，所述猕猴桃种质资源包括软枣猕猴桃、狗枣猕猴桃以及葛枣猕猴桃。优选的，如上所述的猕猴桃种质资源的鉴定方法，所述软枣猕猴桃、狗枣猕猴桃以及葛枣猕猴桃的ITS2序列片段具有如下特征：(1).49bp处：软枣猕猴桃：G；狗枣猕猴桃：G；葛枣猕猴桃：A；(2).61bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：C；(3).67bp处：软枣猕猴桃：T；狗枣猕猴桃：G；葛枣猕猴桃：A；(4).68bp处：软枣猕猴桃：A；狗枣猕猴桃：C；葛枣猕猴桃：A；(5).69bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：C；葛枣猕猴桃：T；(6).81bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：C；葛枣猕猴桃：G；(7).86bp处：软枣猕猴桃：G；狗枣猕猴桃：A；葛枣猕猴桃：G；(8).87bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：C；(9).88bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；(10).92bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；(11).94bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；(12).106bp处：软枣猕猴桃：A；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；(13).111bp处：软枣猕猴桃：A；狗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猕猴桃种质资源的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：扩增待测样品的ITS2序列片段并测序；参照不同已知猕猴桃的ITS2条形码序列进行序列比对，以确定待测样品的猕猴桃种。

【技术特征摘要】
1.一种猕猴桃种质资源的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：扩增待测样品的ITS2序列片段并测序；参照不同已知猕猴桃的ITS2条形码序列进行序列比对，以确定待测样品的猕猴桃种。2.根据权利要求1所述的猕猴桃种质资源的鉴定方法，其特征在于，扩增待测样品的ITS2序列片段时所用的引物对的核苷酸序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。3.根据权利要求2所述的猕猴桃种质资源的鉴定方法，其特征在于，扩增待测样品的ITS2序列片段时的退火温度为53℃～55℃。4.根据权利要求3所述的猕猴桃种质资源的鉴定方法，其特征在于，扩增待测样品的ITS2序列片段时的反应程序为：5.根据权利要求1任一项所述的猕猴桃种质资源的鉴定方法，其特征在于，扩增待测样品的ITS2序列片段时，在PCR反应体系中：DNA模板的浓度≥1.0ng/μL，正反向引物的浓度≥0.01μmol/L。6.根据权利要求1～5任一项所述的猕猴桃种质资源的鉴定方法，其特征在于，所述猕猴桃种质资源包括软枣猕猴桃、狗枣猕猴桃以及葛枣猕猴桃。7.根据权利要求6所述的猕猴桃种质资源的鉴定方法，其特征在于，所述软枣猕猴桃、狗枣猕猴桃以及葛枣猕猴桃的ITS2序列片段具有如下特征：(1).49bp处：软枣猕猴桃：G；狗枣猕猴桃：G；葛枣猕猴桃：A；(2).61bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：C；(3).67bp处：软枣猕猴桃：T；狗枣猕猴桃：G；葛枣猕猴桃：A；(4).68bp处：软枣猕猴桃：A；狗枣猕猴桃：C；葛枣猕猴桃：A；(5).69bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：C；葛枣猕猴桃：T；(6).81bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：C；葛枣猕猴桃：G；(7).86bp处：软枣猕猴桃：G；狗枣猕猴桃：A；葛枣猕猴桃：G；(8).87bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：C；(9).88bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；(10).92bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；(11).94bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；(12).106bp处：软枣猕猴桃：A；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；(13).111bp处：软枣猕猴桃：A；狗枣猕猴桃：G；葛枣猕猴桃：G；(14).124bp处：软枣猕猴桃：G；狗枣猕猴桃：A；葛枣猕猴桃：A；(15).126bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；(16).132bp处：软枣猕猴桃：...

【专利技术属性】
技术研发人员：李昌禹，艾军，刘海双，宋慧芳，秦红艳，孙丹，杨义明，范书田，许培磊，石广丽，王振兴，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，
类型：发明
国别省市：吉林,22