聚合酶组合物、制备和使用所述聚合酶组合物的方法技术

本公开内容提供了用于核酸聚合的组合物、方法、试剂盒、系统和装置。具体地，提供了允许核酸扩增的修饰的聚合酶及其生物活性片段。在一个方面，本公开内容涉及用于核酸测序、基因分型、拷贝数变异分析、双端测序和其它形式的遗传分析的修饰的聚合酶。在一些方面，本公开内容涉及用于产生用于各种下游过程的核酸文库或核酸模板的修饰的聚合酶。在一些方面，本公开内容涉及可跨聚合酶的种类或家族转移以提供具有改变的催化性质的新型聚合酶的同源氨基酸突变的鉴定。在一些方面，本公开内容提供了相较于参照聚合酶具有增强的催化性质的修饰的聚合酶。

Polymerase composition, method for preparation and use of the polymerase composition

The present disclosure provides compositions, methods, kits, systems and devices for nucleic acid polymerization. Specifically, a modified polymerase allowing for nucleic acid amplification and its biologically active fragment are provided. In one aspect, this disclosure relates to modified polymerases for nucleic acid sequencing, genotyping, copy number variation analysis, double ended sequencing, and other forms of genetic analysis. In some aspects, this disclosure relates to a polymerase that is used to produce nucleic acid libraries or nucleic acid templates for various downstream processes. In some respects, this disclosure relates to the identification of a class of amino acid mutations that can be crossed polymerase type or family transfer to provide a novel polymerase with altered catalytic properties. In some respects, this disclosure provides a modified polymerase that has enhanced catalytic properties compared to the reference polymerase.

【技术实现步骤摘要】
聚合酶组合物、制备和使用所述聚合酶组合物的方法本申请是申请日为2012年8月10日、专利技术名称为“聚合酶组合物、制备和使用所述聚合酶组合物的方法”的中国专利技术专利申请No.201280048344.9的分案申请。相关申请的交叉参考本申请要求在35U.S.C.§119(e)下保护2011年8月10日提交的美国临时申请号61/522,125、2011年10月10日提交的美国临时申请号61/545,434、2012年1月10日提交的美国临时申请号61/585,133、2012年5月7日提交的美国临时申请号61/643,844和2012年8月9日提交的标题为"POLYMERASECOMPOSITIONS,METHODSOFMAKINGANDUSINGTHESAME"的美国临时申请号61/681,593的优先权的利益，将所述美国临时申请的公开内容通过引用整体并入本文。序列表本申请因此通过引用并入与其一起提交的电子序列表的材料。将电子序列表中的材料以2012年8月9日创建的标题为“LT00556PCT_Sequence_Listing_ST25.txt”的文本(.txt)文件提交，所述文件具有65KB的文件大小，将其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，本公开内容总地来说涉及聚合酶组合物、制备和使用所述聚合酶组合物的方法。在一些实施方案中，本公开内容总地来说涉及一种或多种修饰聚合酶，其中一种或多种修饰聚合酶相较于参照聚合酶包含至少一个氨基酸突变。在一些实施方案中，本公开内容总地来说涉及包含修饰DNA或RNA聚合酶的组合物。在一些实施方案中，组合物可包含来自A家族DNA聚合酶或B家族DNA聚合酶的修饰聚合酶。在一些实施方案中，本公开内容总地来说涉及跨越聚合酶种类或家族的同源氨基酸突变的转移。在一些实施方案中，本公开内容总地来说涉及用于核酸测序包括下一代测序的聚合酶组合物。在一些实施方案中，本公开内容总地来说涉及用于产生核酸文库或核酸模板的修饰聚合酶组合物。在一些实施方案中，本公开内容涉及包含一种或多种修饰聚合酶的系统、装置和试剂盒。在一些实施方案中，组合物、系统、装置和试剂盒可用于合成DNA链。在一些实施方案中，组合物、系统、装置和试剂盒可用于在单个反应中扩增至少10、50、100、500、1000、2500、5000、7500、10000、25000、50000、100000或更多个核酸模板。背景酶催化生物反应的能力是生命的基础。一些生物应用使用酶来体外合成各种生物分子。一个特别有用的种类的酶是聚合酶，其可催化生物分子(例如，核苷酸或氨基酸)至生物聚合物(例如，核酸或肽)的聚合。例如，可将核苷酸聚合成核酸(特别地以模板依赖性方式)的聚合酶在重组DNA技术和核酸测序应用中是有用的。许多核酸测序法在通过聚合酶催化的体外模板依赖性核酸合成过程中监控核苷酸的掺入。单分子测序(SMS)和双端测序(PES)通常包括用于模板依赖性核酸合成的聚合酶。聚合酶还用于产生核酸文库例如在乳液PCR或桥式PCR过程产生的文库。使用这样的聚合酶产生的核酸文库可用于多种下游过程，例如基因分型、核苷酸多态性(SNP)分析、拷贝数变异分析、表观遗传学分析、基因表达分析、杂交测定、基因突变的分析包括但不限于疾病状态的检测、预后和/或诊断、稀有或低频等位基因突变的检测和分析，以及核酸测序包括但不限于从头测序或目标区域重测序。当进行聚合酶依赖性核酸合成或扩增时，可有用地修饰聚合酶(例如通过突变或化学修饰)，以改变其催化性质。在一些情况下，可有用地修饰聚合酶以增强其催化性质。聚合酶在不同的涉及核酸合成的生物测定中的性能可受聚合酶对核苷酸底物的动力学行为限制。例如，聚合酶活性的分析可因不期望的行为例如给定的聚合酶与模板解离、结合和/或掺入不正确的例如非Watson-Crick碱基配对的核苷酸或释放正确的例如Watson-Crick碱基配对的核苷酸(而不掺入)的倾向而复杂化。这些和其它期望的性质可通过聚合酶的适当选择、选择的聚合酶的工程化和/或修饰来增强。例如，可进行这样的修饰以有利地改变聚合酶的核苷酸掺入速率、结合模板的亲和力、持续合成能力或平均阅读长度；这样的改变可增加从单个测序反应获得的序列信息量。在本领域仍然存在对显示改变的例如增强的持续合成能力、阅读长度(包括无错误阅读长度)和/或对于DNA模板的亲和力的改良聚合酶组合物的需要。这样的聚合酶组合物可用于许多种涉及聚合酶依赖性核酸合成(包括核酸测序和核酸文库的产生)的测定。附图概述并入本说明书并且形成本说明书的部分的附图举例说明了一个或多个示例性实施方案，并且用于解释不同示例性实施方案的原理。附图仅是示例性的和解释性的，并且不被解释为以任意方式进行的限定或限制。图1是概述根据本公开内容的示例性解离速率曲线的示意图。图2是概述根据本公开内容进行的示例性解离测定的示意图。图3是提供根据本公开内容获得的修饰聚合酶相较于参照聚合酶的示例性模板亲和力数据的表。图4是提供使用根据本公开内容的示例性修饰聚合酶获得的示例性核酸测序数据的表。图5是提供使用根据本公开内容的示例性修饰聚合酶获得的示例性核酸测序数据的表。图6显示提供使用根据本公开内容的示例性修饰聚合酶获得的示例性差错率数据的图。图7显示提供使用根据本公开内容的示例性修饰聚合酶获得的示例性差错率数据的图。图8是概述根据本公开内容获得的示例性修饰聚合酶的示例性解离速率曲线的示意图。图9是使用根据本公开内容获得的示例性修饰聚合酶进行的示例性结合亲和力测定。图10是使用根据本公开内容获得的示例性修饰聚合酶进行的示例性结合亲和力测定。图11是使用根据本公开内容获得的示例性修饰聚合酶进行的示例性结合亲和力测定。图12是使用根据本公开内容获得的示例性修饰聚合酶进行的示例性结合亲和力测定。图13是提供使用根据本公开内容的示例性修饰聚合酶获得的示例性核酸测序数据的表。图14是提供使用根据本公开内容的示例性修饰聚合酶获得的示例性核酸测序数据的表。图15是提供使用根据本公开内容的示例性修饰聚合酶获得的示例性核酸测序数据的表。图16是提供使用根据本公开内容的示例性修饰聚合酶获得的示例性核酸测序数据的表。图17提供了使用根据本公开内容的示例性修饰聚合酶获得的示例性核酸测序数据。概述在一些实施方案中，本公开内容总地来说涉及用于进行核苷酸聚合反应的方法，所述方法包括如下步骤或由如下步骤组成：在一种或多种核苷酸存在的情况下将修饰聚合酶或其生物活性片段与核酸模板接触，其中修饰聚合酶或其生物活性片段相对于参照聚合酶包括一个或多个氨基酸修饰并且其中修饰聚合酶或其生物活性片段相对于参照聚合酶具有增加的解离时间常数，以及使用修饰聚合酶或其生物活性片段聚合一个或多个核苷酸的至少一个。在一些实施方案中，方法包括在高离子强度溶液存在的情况下使用修饰聚合酶或其生物活性片段聚合一个或多个核苷酸的至少一个。在一些实施方案中，方法还可包括以模板依赖性方式聚合至少一个核苷酸。在一些实施方案中，方法还可包括在接触之前、期间或之后将引物与模板杂交，并且其中聚合包括使用修饰聚合酶或其生物活性片段将至少一个核苷酸聚合至引物的末端。在一些实施方案中，在能够检测至少一个核苷酸被修饰聚合酶或其生物活性片段本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于进行核酸扩增的方法，包括：产生具有修饰的聚合酶、引物、核酸模板以及一个或多个核苷酸的扩增反应混合物，其中所述修饰的聚合酶具有SEQ ID NO:15所示的序列，并且还包含选自下组的一个或多个氨基酸取代：E471K、N485R、R492K、D513K、A675K、D732R、S739W、V740R和E745Q，其中所述编号是相对于SEQ ID NO:15的氨基酸序列的，并且所述修饰的聚合酶相对于具有SEQ ID NO:15所示序列的参照聚合酶具有增加的解离时间常数；和将扩增反应混合物经历扩增条件，其中使用所述修饰的聚合酶将所述一个或多个核苷酸的至少一个聚合至引物的末端。

【技术特征摘要】
2011.08.10 US 61/522,125;2011.10.10 US 61/545,434;1.一种用于进行核酸扩增的方法，包括：产生具有修饰的聚合酶、引物、核酸模板以及一个或多个核苷酸的扩增反应混合物，其中所述修饰的聚合酶具有SEQIDNO:15所示的序列，并且还包含选自下组的一个或多个氨基酸取代：E471K、N485R、R492K、D513K、A675K、D732R、S739W、V740R和E745Q，其中所述编号是相对于SEQIDNO:15的氨基酸序列的，并且所述修饰的聚合酶相对于具有SEQIDNO:15所示序列的参照聚合酶具有增加的解离时间常数；和将扩增反应混合物经历扩增条件，其中使用所述修饰的聚合酶将所述一个或多个核苷酸的至少一个聚合至引物的末端。2.权利要求1所述的方法，其中所述扩增条件包括高离子强度溶液的存在。3.权利要求2所述的方法，其中所述高离子强度溶液含有约100mM至约500mM的盐。4.权利要求3所述的方法，其中所述盐包括NaCl和/或KCl。5.权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·范德霍恩，T·尼基弗罗夫，罗国斌，M·兰狄斯，D·马祖尔，E·托泽，T·林斯库姆，
申请(专利权)人：生命技术公司，
类型：发明
国别省市：美国,US