真核生物中原卟啉原氧化酶酶活力的操作制造技术

本发明专利技术提供编码自然原卟啉原氧化酶（ｐｒｏｔｏｘ）及其除草剂耐受性的修饰形式的新的真核ＤＮＡ序列。也提供了具有改变的原卟啉原氧化酶活力，并对除草剂有耐受性的植物。这些植物可以是培养或基因工程处理后而对原卟啉原氧化酶抑制剂有抗性，这通过将自然原卟啉原氧化酶基因突变成抗性形式或通过提高自然原卟啉原氧化酶基因表达水平，或用修饰的真核或原核原卟啉原氧化酶编码序列或除草剂耐受性野生型原核原卟啉原氧化酶序列转化实现。还描述了新的真核原卟啉原氧化酶序列在诊断及其他方面的用途。还公开了编码野生型和改变了的原卟啉原氧化酶的植物基因，纯化的植物原卟啉原氧化酶，从植物中分离原卟啉原氧化酶的方法，使用原卟啉原氧化酶编编基因的方法。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术一般涉及一种酶活力的操作，该酶在所有真核生物的普通生物合成途径中负责将原卟啉原IX转化成原啉啉IX。一方面，本专利技术可用于发展植物，植物组织，种子对除草剂的抗性，另一方面，本专利技术可用于发展对动物，尤其是人类缺乏这种酶活力的诊断和治疗。导致产生叶绿素和血红素的生物合成途径有许多相同步骤。叶绿素是所有绿色光合生物中的光收集色素。血红素是血红蛋白，细胞色素，P450混合功能单加氧酶、过氧化物酶及过氧化物酶的辅助因子(见如Lehninger，“生物化学”Wroth出版公司，纽约(1975))，并且是所有需氧生物的必需组份。叶绿素和血红素生物合成的最后相同步骤是原卟啉原IX到原卟啉IX的氧化。原卟啉原氧化酶(本文称为”Protox”)是催化这个最后步骤的酶(Matringe等人，生物化学杂志260231(1989))。这个原卟啉原氧化酶已从许多种生物中或完全纯化，这些生物包括酿酒酵母(Labbe-Bios和Labbe，见“血红素和叶绿素的合成”，E.H.Dailey ed.McGraw Hill纽约.pp 235-285(1990))，大麦白色体(Jacobs和Jacobs，“生物化学杂志”244219(1987))和小鼠肝脏(Dailey和Karr，生物化学262697(1987))。编码原卟啉原氧化酶(Protox)的基因已从两种原核生物中分离出，这两种原核生物是大肠杆菌(E.coli)(Sasarman等人，加拿大微生物学杂志391155(1993))和枯草芽孢杆菌(Dailey等人，生物化学杂志269813(1994))。这些基因没有序列相似性，它们推定的蛋白质产物也没有任何氨基酸序列相似性。大肠杆菌的蛋白约21KDa，并与细胞膜相联。枯草芽孢杆菌蛋白为51KDa，是一个可溶的，细胞质中表现活力的蛋白。目前，对原卟啉原氧化酶了解太少，因而还不能用已知的方法从较高等的真核生物(也就是动物，植物和其它除了如酵母，单细胞藻类，原生动物等的低等真核微生物以外的所有多细胞具核的生物)中分离编码原卟啉原氧化酶(protox)的基因。具体的说，一些分离新蛋白和基因的标准技术是建立在假定它们的初级结构(也就是氨基酸和DNA序列)与具有相同功能的已知蛋白和基因有高度相似性基础上的。那些标准方法包括核酸杂交和聚合酶链式反应扩增，其中聚合酶链式反应采用与保守的氨基酸序列基序(motif)对应的寡聚核苷酸引物。这些技术如果采用目前局限于原核原卟啉原氧化酶基因的结构信息对真核原卟啉原氧化酶基因的分离是没有用的。因为即使在知道的原核原卟啉原氧化酶基因和蛋白中都没有明显的结构相似性。另一个曾经用于从高等真核生物的其它代谢途径中分离生物合成基因的方法是对所需活力缺陷的微生物突变型进行互补。对于这个方法，一个高等真核生物的cDNA文库克隆在一个能在受体微生物中直接表达该cDNA的载体中。然后将这个载体转化或导入突变微生物中，选出表型不再是突变型的菌落。在一些代谢路径中采用了这种策略从高等真核生物中分离基因，包括组氨酸生物合成(如本文引入其全文作为参考的美国专利5290926和WO 94/026909至Ward等人.)，赖氨酸生物合成(如Frisch等人，分子基因遗传228287(1991))，嘌呤生物合成(如，Aimi等人，生物化学杂志2659011(1990))，色氨酸生物合成(如Nigogi等人，植物细胞51011(1993))。然而尽管可以获得认为是原卟啉原氧化酶活力缺陷的微生物突变型(如大肠杆菌(Sasar-man.等人，基因微生物杂志113297(1979)，鼠伤寒沙门氏菌(Xu等人，细菌学杂志1743953(1992))和酿酒酵母(Camadro等人，生化生物物理研究通报106724(1982))，在已知信息基础上采用这种技术去分离编码真核原卟啉原氧化酶活性的cDNA是最不可预知的。这样说是有几个原因的，首先真核原卟啉原氧化酶cDNA序列在突变微生物中不能达到足够水平的表达。比如因为使用的密码子与受体微生物采用的密码子不一致。第二克隆的真核编码序列的初始转译产物可能不能产生有功能的多肽。如如果活力要求一个转译后修饰，比如糖基化，而这不能在微生物中进行。第三这个真核蛋白在微生物受体中不能形成其有活力的构象。比如如果这个蛋白通常作用于一个专一的细胞器膜系统，而微生物受体专一性缺乏这个系统。最后一种可能性对于植物原卟啉原氧化酶更为可能，因为此酶在植物细胞中是与补偿测试中微生物受体不具有的细胞器相联的。具体地说，植物原卟啉原氧化酶是与叶绿体膜和类体膜相联系的(Matringe等人，生物化学杂志2674646(1992))，并且可以假定以包括N-末端转译(transit)序列和成熟多肽内部特性转译后靶向机制为结果到达那些膜(见如Kohorn和Tobin，植物细胞1159(1989)；Li等人，植物细胞3709(1991)；Li等人，生物化学杂志26718999(1992))这些原卟啉原氧化酶已知在一些人类疾病中起作用。在患有杂色卟啉症，一种以神经精神病症状和皮肤损伤为特征的常染色体显性紊乱病的病人中，原卟啉原氧化酶活力水平下降(Brenner和Bloomer，新英格兰医学杂志302765(1980))。由于缺乏关于人类原卟啉原氧化酶及其对应基因的知识，对这种紊乱的诊断和治疗的选择在目前是很有限的。采用除草剂控制不想要的的植被，如作物中的杂草或植物，这几乎已得到广泛的应用。相关的交易额每年超过了十亿美元。尽管广泛使用除草剂，对于农民控制杂草仍是一个巨大的且耗资的问题。有效地使用除草剂要求良好的管理。比如施用除草剂的时间和方法以及杂草植物生长阶段对更好的控制杂草是关键的。因为许多种类杂草对除草剂有抗性，生产有效的除草剂变得越来越重要。不幸的是，那些表现很大潜力，有广谱除草和在土壤中快速降解的除草剂对作物有较大的植物毒性。一个解决这个问题的方法就是建立能够抵抗或耐受杀草剂的作物。对除草剂有抗性的作物杂交种或变种允许使用除草剂而不会提高破坏作物的危险。建立抗性可采用对作物施用除草剂的方法，而这种除草剂由于是作物敏感的而事先或有限的施用的(如出现前施用)。如美国专利4,761,373至Anderson等人，教导丁对咪唑啉酮或硫基硫胺类除草剂有抗性的植物。这种抗性可以通过一个改变了的乙酰羟基酸合成酶(AHAS)证实。Goodman等人 的美国专利No.4,975,374涉及包含一种编码一个突变谷胺酰胺合成酶(GS)的基因的植物细胞和植物能够对已知抑制GS的除草剂，如phosphinothrici和蛋氨酸硫氧亚胺的抑制产生抗性Bedbrook等人的美国专利No.5,013,659指导的能够表达一种突变乙酰乳酸合成酶的植物对磺酰脲除草剂的抑制有抗性。Somers等人的美国专利No.5,162,602发现一些植物对环己二酮和芳基氧基苯氧基丙酸除草剂的抑制能够耐受，这个耐受性能通过一个改变了的乙酰辅酶A羧化酶(Accase)证实。原卟啉原氧化酶是多种除草剂类化合物的靶点。除草剂在酶分子的不同结构层次上抑制原卟啉原氧化酶(protox)(Duke等人，杂草科学(Weed Sci.)39465(1991)；Nandihalli等本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种控制不需要的植被生长的方法，该方法包括给包括其子代的植物种群施用有效量的原卟啉原氧化酶抑制型除草剂，所说的植物包含一种编码修饰的原卟啉原氧化酶，包括具有至少一个氨基酸修饰的真核原卟啉原氧化酶的ＤＮＡ分子，其中所说的修饰的原卟啉原氧化酶能耐受抑制所说的真核原卟啉原氧化酶量的除草剂，其中所说的真核原卟啉原氧化酶包括： （ａ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２中所示的氨基酸序列并且其中所说的至少一个氨基酸修饰是选自ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２的２２０位丙氨酸，２２１位甘氨酸和４２６位酪氨酸的氨基酸取代；或 （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６中所示的氨基酸序列并且其中所说的至少一个氨基酸修饰是选自ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６的１６６位丙氨酸，１６７位甘氨酸和３７２位酪氨酸的氨基酸取代； 其中所说的ＤＮＡ分子在所说的植物中被表达并使所说的植物能耐受抑制所说的真核原卟啉原氧化酶量的除草剂。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：ER瓦德，S沃勒拉茨，
申请(专利权)人：辛根塔参与股份公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]