一种胱硫醚β‑合酶基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒及测定方法技术

本发明专利技术公开了一种胱硫醚β‑合酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，该检测试剂盒包括DAN提取液、荧光定量PCR反应液、阳性对照、阴性对照和多个带盖密封管，所述荧光定量PCR反应液包括一对胱硫醚β‑合酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。本发明专利技术还公开了一种胱硫醚β‑合酶基因启动子区甲基化程度的测定方法。本发明专利技术所述的胱硫醚β‑合酶基因胱硫醚β‑合酶基因启动子区甲基化程度胱硫醚β‑合酶基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒采用荧光定量PCR技术，具有实时监测，特异性强，精确定量的优势，确保诊断结果的精确性。

A cystathionine beta synthase gene methylation of promoter region of the kit and a determination method

The invention discloses a cystathionine beta synthase gene promoter region methylation detection kit, the kit includes DAN extract, fluorescence quantitative PCR reaction liquid, positive control, negative control and a plurality of sealing tube with cover, the fluorescent quantitative PCR reaction solution includes a pair of sulfur ether beta synthase gene promoter region methylation specific primers of SEQ ID and SEQ NO.1 ID NO.2. The invention also discloses a cystathionine beta synthase determination of promoter methylation of gene promoter. Cystathionine beta the cystathionine beta synthase gene synthase gene promoter methylation of cystathionine beta synthase gene promoter kit promoter methylation level by fluorescent quantitative PCR technology, with real-time monitoring, strong specificity, accurate quantitative advantage. To ensure the accuracy of diagnosis results.

【技术实现步骤摘要】
一种胱硫醚β-合酶基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒及测定方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种胱硫醚β-合酶基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒及测定方法。
技术介绍
脑卒中(cerebralstroke)是一种急性脑血管疾病，是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病，包括缺血性和出血性卒中。脑卒中具有发病率高、死亡率高和致残率高的特点，临床表现为严重头痛、昏厥、失去意识等，这也成为了中国成年人残疾的首要原因。脑卒中患者需要长期服用降压药，定期进行常规检查，控制颅内压，可见脑卒中患者给社会和家庭带来了极大的经济负担。脑卒中是一种由遗传和环境因素共同作用引起的复杂性疾病，对脑卒中发病机制的探索进而寻找出适合诊断治疗药物已然成为了现今研究的一个热点。而在脑卒中的发病机制尚未清晰阐明的情况下，对脑卒中的预防以及早期检测更是刻不容缓。胱硫醚β-合酶(Cystathioninebeta-synthase，CBS)是一种蛋白编码基因，它编码的蛋白催化同型半胱氨酸胱硫醚的转换，以腺苷蛋氨酸变构激活和使用磷酸吡哆醛作为辅助因子。该基因的缺乏导致蛋白合成障碍是高蛋氨酸血症的极大风险因素，进而提高脑卒中的患病风险。胱硫醚β-合酶是由位于21号染色体的胱硫醚β-合酶基因(Cystathioninebeta-synthase，CBS)(Chr21：44497096-44497188)编码而成的。现在国内外的研究已经确定同型半胱氨酸水平与脑卒中的发生有关联，但是对同型半胱氨酸水平的影响因素与其调控机制的研究较少。目前，还没有关于胱硫醚β-合酶基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒和测定方法。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种胱硫醚β-合酶基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒，对指定基因启动子区域DNA甲基化水平的进行测定，是一种检测方便、普适度高、准确率高的检测试剂盒。本专利技术的另一目的在于提供一种胱硫醚β-合酶基因启动子区甲基化程度的测定方法，该方法检测方便、普适度高、准确率高。为实现本专利技术的第一个目的本专利技术所采用的技术方案如下：一种胱硫醚β-合酶基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒，该检测试剂盒包括DAN提取液、荧光定量PCR反应液、阳性对照、阴性对照和多个带盖密封管，所述荧光定量PCR反应液包括一对胱硫醚β-合酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物：PrimerF：5’-GGATGGAGTTATATTATGAAGGT-3’(SEQIDNO.1)和PrimerR：5’-AACAATCTCGCTCAATCG-3’(SEQIDNO.2)。作为进一步的方案，本专利技术所述的检测试剂盒还包括洗涤液和洗脱液。作为进一步的方案，本专利技术所述的荧光定量PCR反应液还包括10×PCRbuffer、MgCl2、dNTPs、热启动TaqDNA酶、DNA模板、无菌双蒸水以及荧光染料。作为进一步的方案，本专利技术所述的荧光染料为2×SYBRGreenI。作为进一步的方案，本专利技术所述的PCR反应液为10×PCRbuffer2μL、25mmol/LMgCl21.5μL、2.5mmol/LdNTPs1.5μL、10μMPrimerF0.25μL、10μMPrimerR0.25μL、5U/μL热启动TaqDNA酶0.2μL、DNA模板1μL、2×SYBRGreenI5μL、无菌双蒸水补足至20μL。作为进一步的方案，本专利技术所述的阳性对照为正常人样本的基因组完全甲基化后所得到的完全DNA甲基化样本；所述的阴性对照为无菌双蒸水。为实现本专利技术的第二个目的本专利技术所采用的技术方案如下：一种胱硫醚β-合酶基因启动子区甲基化程度的测定方法，利用本专利技术所述的胱硫醚β-合酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒测进行测定，包括DNA提取步骤：提取全血基因组DNA并检测DNA的浓度；用甲基化试剂盒对全血基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化步骤：用EZDNAMethylation-Gold试剂盒将上述提取额全血基因组DNA与亚硫酸氢盐反应会使单链中未甲基化的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶，然后经过上样、洗涤、洗脱等步骤得到转化后的DNA；DNA甲基化水平测定步骤：上述转化后的DNA作为样本DNA加入含荧光定量PCR反应液进行PCR扩增反应，使基因序列进行倍数扩增，每一个样本DNA对应一个的扩增曲线；曲线与既设阈值相交的横坐标点即为CT值，并通过下述计算式计算出甲基化率：ΔΔCt＝DNA样本(CT靶基因-CTACTB)-阳性对照(CT靶基因-CTACTB)；其中，ΔΔCt是指甲基化率，CT靶基因是指目标基因的PCR循环数即胱硫醚β-合酶基因的Ct值，CTACTB是指一种常用的内参基因即ACTB的PCR循环数。作为进一步的方案，上述方法中所述的PCR反应液为10×PCRbuffer2μL、25mmol/LMgCl21.5μL、2.5mmol/LdNTPs1.5μL、10μMPrimerF0.25μL、10μMPrimerR0.25μL、5U/μL热启动TaqDNA酶0.2μL、DNA模板1μL、2×SYBRGreenI5μL、无菌双蒸水补足至20μL。作为进一步的方案，上述方法中所述的甲基化水平测定步骤具体如下：首先将转化后的DNA样本加入到热启动TaqDNA酶中，然后加入一对胱硫醚β-合酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物PrimerF和PrimerR；最后依次加入DNA模板、10×PCRbuffer、MgCl2、dNTPs、2×SYBRGreenI以及无菌双蒸水。作为进一步的方案，上述方法中所述的PCR扩增反应条件如下：预变性95℃，10min；95℃，20s，退火温度，20s，72℃，single，30s，45个循环；溶解曲线95℃，15s，60℃，60s，95℃，continuous；保温40℃，10min。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：1.本专利技术所述的胱硫醚β-合酶基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒采用荧光定量PCR技术，具有实时监测，特异性强，精确定量的优势，确保诊断结果的精确性；2.本专利技术所述的胱硫醚β-合酶基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒是基于血浆、唾液、尿液等体液检查的试剂盒，随时随地进行检测，并且能在较短时间内取得检测结果；3.本专利技术所述的胱硫醚β-合酶基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒检测费用低、易于为大众所接受。下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明。附图说明图1为胱硫醚β-合酶基因的染色体定位图。图2为胱硫醚β-合酶基因的测序图。图3为胱硫醚β-合酶基因的电泳图。具体实施方式本专利技术所述的胱硫醚β-合酶基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒，该检测试剂盒包括DAN提取液、荧光定量PCR反应液、阳性对照、阴性对照和多个带盖密封管，所述荧光定量PCR反应液包括一对胱硫醚β-合酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物：PrimerF：5’-GGATGGAGTTATATTATGAAGGT-3’(SEQIDNO.1)和PrimerR：5’-AACAATCTCGCTCAATCG-3’(SEQIDNO.2)。作为进一步的方案，本专利技术所述的检测试剂盒还包括洗涤液和洗脱液。作为进一步的方案，本专利技术所述的荧光定量PCR反应液还包括10×本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胱硫醚β‑合酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒包括DAN提取液、荧光定量PCR反应液、阳性对照、阴性对照和多个带盖密封管，所述荧光定量PCR反应液包括一对胱硫醚β‑合酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物：Primer F：5’‑GGATGGAGTTATATTATGAAGGT‑3’和Primer R：5’‑AACAATCTCGCTCAATCG‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种胱硫醚β-合酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒包括DAN提取液、荧光定量PCR反应液、阳性对照、阴性对照和多个带盖密封管，所述荧光定量PCR反应液包括一对胱硫醚β-合酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物：PrimerF：5’-GGATGGAGTTATATTATGAAGGT-3’和PrimerR：5’-AACAATCTCGCTCAATCG-3’。2.根据权利要求1所述的胱硫醚β-合酶基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒还包括洗涤液和洗脱液。3.根据权利要求2所述的胱硫醚β-合酶基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR反应液还包括10×PCRbuffer、MgCl2、dNTPs、热启动TaqDNA酶、DNA模板、无菌双蒸水以及荧光染料。4.根据权利要求3所述的胱硫醚β-合酶基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为2×SYBRGreenI。5.根据权利要求4所述的胱硫醚β-合酶基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液为10×PCRbuffer2μL、25mmol/LMgCl21.5μL、2.5mmol/LdNTPs1.5μL、10μMPrimerF0.25μL、10μMPrimerR0.25μL、5U/μL热启动TaqDNA酶0.2μL、DNA模板1μL、2×SYBRGreenI5μL、无菌双蒸水补足至20μL。6.根据权利要求1所述的胱硫醚β-合酶基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为正常人样本的基因组完全甲基化后所得到的完全DNA甲基化样本；所述阴性对照为无菌双蒸水。7.一种胱硫醚β-合酶基因启动子区甲基化程度的测定方法，其特征在于，利用如权利要求1所述的胱硫醚β-合酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒测进行测定，包括DNA提取步骤：提取全血基因组DNA并检测DNA的浓度；用甲基化试剂盒对全血基因组DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩丽媛，季慧慧，段东辉，许国栋，段世伟，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33