促进3β-HSD基因表达的表达载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种促进3β‑HSD基因表达的表达载体及其构建方法和应用。该表达载体包括慢病毒载体pLVX‑mCMV‑ZsGreen‑PGK‑Puro的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列以及目的基因表达片段。目的基因表达片段正向插入在EcoRI酶切位点和NotI酶切位点之间。该表达载体能够转染到人源细胞中，并在人源细胞中持续、稳定且高效表达3β‑HSD基因。该表达载体还能增加塑化剂对肿瘤细胞的损害作用，有望应用在抗肿瘤的药物中。

To promote the 3 beta expression vector of HSD gene expression and its construction method and Application

The invention discloses a method for promoting 3 beta expression vector of HSD gene expression and its construction method and application. The expression vector comprises a lentiviral vector of pLVX mCMV ZsGreen PGK Puro basic sequence, sequence, gene sequence, multiple cloning sites of promoter sequences and the expression of target gene fragment. The target gene fragment was inserted between the EcoRI cleavage site and the NotI cleavage site. The expression vector can be transfected into human cells, and sustained, stable and efficient expression of 3 beta HSD gene in human cells. The expression vector can also increase the damage of plasticizer to tumor cells, and is expected to be used in antitumor drugs.

【技术实现步骤摘要】
促进3β-HSD基因表达的表达载体及其构建方法和应用
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种促进3β-HSD基因表达的表达载体及其构建方法和应用。
技术介绍
固醇激素在大多数脊椎动物细胞的分化、发育、生长和生理功能的发挥中起重要的作用。类固醇激素的生成有赖于原料胆固醇的提供及一系列的类固醇生成酶的催化。其中，3β-超类固醇脱氨酶(3β-HSD)在糖皮质激素、盐皮质激素和性激素的生物合成中起重要的作用。传统的3β-HSD基因表达技术中，例如柳海燕等利用促性腺激素释放激素激动剂通过ERKMAPK途径实现了大鼠睾丸间质细胞3β-HSD基因表达的调控；祝辉等则研究了hCG对成年小鼠睾丸Leydig细胞中3β-HSD表达的调节。上述研究均为应用间接手段调控3β-HSD基因表达，目前缺乏能够转染到人源细胞，并在人源细胞中持续、稳定且高效表达3β-HSD基因的表达载体。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种能够在人源细胞中持续、稳定且高效表达3β-HSD基因的表达载体及其构建方法和应用。一种促进3β-HSD基因表达的表达载体，包括慢病毒载体pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列以及目的基因表达片段，所述多克隆位点包括EcoRI酶切位点和NotI酶切位点，所述目的基因表达片段中含有用于表达3β-HSD的3β-HSD基因编码序列，所述目的基因表达片段的5’端具有EcoRI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的3’端具有NotI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段正向插入在所述多克隆位点序列的所述EcoRI酶切位点和所述NotI酶切位点之间。在一个实施方式中，所述3β-HSD基因编码序列的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。在一个实施方式中，所述EcoRI酶切位点黏性末端的3’端直接与所述3β-HSD基因编码序列的5’端连接，所述NotI酶切位点黏性末端的5’端直接与所述3β-HSD基因编码序列的3’端连接，所述EcoRI酶切位点黏性末端的碱基序列为5’-aattc-3’，所述NotI酶切位点黏性末端的碱基序列为5’-ggccgc-3’。一实施方式的促进3β-HSD基因表达的表达载体的构建方法，包括以下步骤：以3β-HSD基因编码序列作为扩增模板，并加入上游引物和下游引物后进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，所述上游引物包括针对所述3β-HSD基因编码序列的5’端设计的序列和针对EcoRI酶切位点设计的序列，所述下游引物包括针对所述3β-HSD基因编码序列的3’端设计的序列和针对NotI酶切位点设计的序列；对所述PCR扩增产物进行加A尾反应，使得所述PCR扩增产物的两端连接A碱基，并将加A尾反应后的所述PCR扩增产物连接到T载体中，得到重组T载体；用限制性内切酶EcoRI和限制性内切酶NotI对所述重组T载体进行双酶切，得到目的基因表达片段；以及将所述目的基因表达片段连接到经过限制性内切酶EcoRI和限制性内切酶NotI双酶切处理后的慢病毒载体pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro中，得到所述促进3β-HSD基因表达的表达载体。在一个实施方式中，所述3β-HSD基因编码序列的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述上游引物的碱基序列如SEQIDNo.2所示，所述下游引物的碱基序列如SEQIDNo.3所示。一种含有3β-HSD基因的慢病毒，通过如下方法制备得到：将上述的促进3β-HSD基因表达的表达载体转染进入293FT细胞中；以及对转染后的所述293FT细胞扩增表达，获得所述含有3β-HSD基因的慢病毒。一种组合物在制备抗肿瘤的药物中的应用，所述组合物包括上述促进3β-HSD基因表达的表达载体。在一个实施方式的应用中，所述组合物还包括塑化剂。在一个实施方式的应用中，所述塑化剂为邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯。在一个实施方式的应用中，所述组合物用于制备抗乳腺癌的药物。上述促进3β-HSD基因表达的表达载体包括慢病毒载体pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列以及目的基因表达片段。多克隆位点序列包括EcoRI酶切位点和NotI酶切位点，目的基因表达片段中含有用于表达3β-HSD的3β-HSD基因编码序列，目的基因表达片段的5’端具有EcoRI酶切位点黏性末端，3’端连具有NotI酶切位点黏性末端。目的基因表达片段正向插入在多克隆位点序列的EcoRI酶切位点和NotI酶切位点之间。专利技术人在载体的选择、目的基因插入位点、构建方法等方面进行了大量的探索研究，预料不到地发现，将含有3β-HSD基因编码序列的目的基因表达片段正向插入在慢病毒载体pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro的EcoRI酶切位点和NotI酶切位点之间，成功地构建出能够特异性促进3β-HSD基因表达的表达载体。实验结果表明该表达载体能够转染到人源细胞中，并在人源细胞中持续、稳定且高效表达3β-HSD基因。转染了该促进3β-HSD基因表达的表达载体的乳腺癌细胞系MCF-7细胞表达的3β-HSD是对照组的104.5倍，表达量具有显著的差异。该表达载体还能增加塑化剂对肿瘤细胞的毒性，实验结果表明，转染了该表达载体的人乳腺癌细胞MCF-7的凋亡基因、雌激素受体基因以及DNA氧化损伤基因表达水平均高于未转染的人乳腺癌细胞MCF-7，该表达载体能够加速肿瘤细胞的凋亡，增加塑化剂对肿瘤细胞的损害作用，有望应用在抗肿瘤的药物中，为肿瘤治疗提供一种思路。附图说明图1为一实施方式的促进3β-HSD基因表达的表达载体的构建方法的流程图；图2为实施例1中3β-HSD基因编码序列PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；图3为实施例1中所用的pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro骨架载体的谱图；图4为实施例4中荧光定量PCR检测MCF-7细胞和转染促进3β-HSD基因表达的表达载体的MCF-7细胞的3β-HSD的mRNA表达水平结果图；图5为实施例5中Westernblot检测两组细胞3β-HSD蛋白表达水平的结果图；图6为对图5中的图像用ImageJ软件进行条带灰度定量分析3β-HSD蛋白表达水平结果图；图7为实施例6中荧光定量PCR检测不同浓度的DEHP条件下，两组乳腺癌细胞MCF-7的凋亡基因Bax的mRNA表达水平结果图；图8为实施例6中荧光定量PCR检测不同浓度的DEHP条件下，两组乳腺癌细胞MCF-7的凋亡基因Caspase-3的mRNA表达水平结果图；图9为实施例6中荧光定量PCR检测不同浓度的DEHP条件下，两组乳腺癌细胞MCF-7的凋亡基因Caspase-8的mRNA表达水平结果图；图10为实施例6中荧光定量PCR检测不同浓度的DEHP条件下，两组乳腺癌细胞MCF-7的雌激素受体基因ERα的mRNA表达水平结果图；图11为实施例6中荧光定量PCR检测不同浓度的DEHP条件下，两组乳腺癌细胞MCF-7的雌激素受体基因ERβ的mRNA表达水平结果图；图12为实施例6中荧光定量PCR检测不同浓度的DEHP条件下，两组乳腺癌细胞MCF-7的DNA损伤基因hOGG1的mRNA表达水平结果图；图13为实施例6中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种促进3β‑HSD基因表达的表达载体，其特征在于，包括慢病毒载体pLVX‑mCMV‑ZsGreen‑PGK‑Puro的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列以及目的基因表达片段，所述多克隆位点包括EcoRI酶切位点和NotI酶切位点，所述目的基因表达片段中含有用于表达3β‑HSD的3β‑HSD基因编码序列，所述目的基因表达片段的5’端具有EcoRI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的3’端具有NotI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段正向插入在所述多克隆位点序列的所述EcoRI酶切位点和所述NotI酶切位点之间。

【技术特征摘要】
1.一种促进3β-HSD基因表达的表达载体，其特征在于，包括慢病毒载体pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列以及目的基因表达片段，所述多克隆位点包括EcoRI酶切位点和NotI酶切位点，所述目的基因表达片段中含有用于表达3β-HSD的3β-HSD基因编码序列，所述目的基因表达片段的5’端具有EcoRI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的3’端具有NotI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段正向插入在所述多克隆位点序列的所述EcoRI酶切位点和所述NotI酶切位点之间。2.根据权利要求1所述的促进3β-HSD基因表达的表达载体，其特征在于，所述3β-HSD基因编码序列的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。3.根据权利要求1所述的促进3β-HSD基因表达的表达载体，其特征在于，所述EcoRI酶切位点黏性末端的3’端直接与所述3β-HSD基因编码序列的5’端连接，所述NotI酶切位点黏性末端的5’端直接与所述3β-HSD基因编码序列的3’端连接，所述EcoRI酶切位点黏性末端的碱基序列为5’-aattc-3’，所述NotI酶切位点黏性末端的碱基序列为5’-ggccgc-3’。4.如权利要求1～3任一项所述的促进3β-HSD基因表达的表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：以3β-HSD基因编码序列作为扩增模板，并加入上游引物和下游引物后进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，所述上游引物包括针对所述3β-HSD基因编码序列的5’端设计的序列和针对EcoRI酶切位点设计的序列，所述下游引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐新云，王利，毛侃琅，彭鹏，
申请(专利权)人：深圳市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：广东,44