一种人工诱导多能干细胞分化为红细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种人工诱导多能干细胞分化为红细胞的方法，该方法具体步骤如下：取胚胎干细胞接种在小鼠胚胎成纤维细胞培养层上；胚胎干细胞的常规培养；胚胎干细胞预诱导形成胚胎体；胚胎干细胞定向分化形成造血干细胞；将消化后的干细胞加入至脱核诱导培养基重悬细胞，接种于培养皿中，培养20d后得到定向分化的红细胞。本发明专利技术通过在胚胎干细胞向造血干细胞定向转化过程中加入干细胞因子(SCF)，采用分阶诱导的方式促使细胞分化，诱导使用的干细胞来源于胚胎干细胞，易于体外扩增，取材方便，提供了一种经济安全，行之有效的新的红细胞来源。

Method for inducing artificial pluripotent stem cells to differentiate into red blood cells

The present invention discloses a kind of induced pluripotent stem cells to differentiate into methods of red blood cells, the method includes the following steps: from the embryonic stem cells were seeded cell culture layer in mouse embryo; cultured embryonic stem cells; embryonic stem cells induced by pre embryo formation; differentiation of embryonic stem cells into hematopoietic stem cells after digestion of stem cells; will be added to the removal of nuclear induction medium cell suspension was inoculated in the culture dish and cultured 20d obtained after the differentiation of red blood cells. By adding the stem cell factor into hematopoietic stem cells transformation process in embryonic stem cells (SCF), the order induced way to promote cell differentiation induced by the use of stem cells derived from embryonic stem cells, easy to amplify in vitro, provides a convenient, effective economic security, the new red blood cells source.

【技术实现步骤摘要】
一种人工诱导多能干细胞分化为红细胞的方法
本专利技术属于生物医学领域，特别是涉及一种人工诱导多能干细胞分化为红细胞的方法。
技术介绍
目前，人红细胞是血液中数量最多的一种血细胞，红细胞是血液运送氧气的最主要的媒介。当人失血时，需要快速的补充红细胞，而目前红细胞来源主要是人体血液，而输注的人血主要来源于志愿献血者或是职业卖血者，不但血源奇缺，且价格昂贵，此外，血液中还可能携带病毒等，给需要输送血液的人的生命造成额外的威胁。因此，目前的红细胞来源非常单一，且产量极其有限，不能满足需要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种人工诱导多能干细胞分化为红细胞的方法，，诱导使用的干细胞来源于胚胎干细胞，易于体外扩增，取材方便，提供了一种经济安全，行之有效的新的红细胞来源。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种人工诱导多能干细胞分化为红细胞的方法，该方法具体步骤如下：S1、取胚胎干细胞接种在小鼠胚胎成纤维细胞培养层上；S2、胚胎干细胞的常规培养；S3、胚胎干细胞预诱导形成胚胎体；S4、胚胎干细胞定向分化形成造血干细胞；S5、将消化后的干细胞加入至脱核诱导培养基重悬细胞，接种于培养皿中，培养20d后得到定向分化的红细胞；进一步地，所述S1中培养液成分为，85％DMEM培养基中加入15％KnockoutSerumReplacement、4ng/mLbFGF、1-1.5mmol谷氨酰胺、0.1-0.15mol/Lβ-巯基乙醇、1mmol/L非必需氨基酸、50μg/mL链霉素、50μg/mL青霉素。进一步地，所述S2中的具体步骤为，将S1中的培养基置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，37℃条件下加入1mg/ml胶原酶Ⅳ进行消化传代，接种于新的饲养层细胞上，传代比例1:5-6。进一步地，所述S3中的具体步骤为，将S2中的胚胎干细胞继续培养5-6d后取上清液,离心去细胞碎片,上清液过0.22μm滤膜,过滤后接种于含15％FCS，0.9％甲基纤维素的IMDM液中，并加入30-50ng/mLSCF，置于六孔培养板上悬浮3-4d形成胚胎体。进一步地，所述S4中的具体步骤为，用PBS液吹打所述胚胎体，离心沉淀后加入胰蛋白酶消化，并吹打成单个小细胞团，以lx105mL-1的细胞密度接种于骨髓基质细胞饲养层，并加入50ng/mLSCF，37℃，5％CO2培养箱中培养，每5-6d换液一次，培养20-22d形成造血干细胞。进一步地，所述脱核诱导培养基为StemSpan无血清培养基为基础培养基中加入10-12U/mlEPO和40-50ng/mlIGF-1。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术通过在胚胎干细胞向造血干细胞定向转化过程中加入干细胞因子(SCF)，采用分阶诱导的方式促使细胞分化，诱导使用的干细胞来源于胚胎干细胞，易于体外扩增，取材方便，提供了一种经济安全，行之有效的新的红细胞来源。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。具体实施方式本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术为一种人工诱导多能干细胞分化为红细胞的方法，该方法具体步骤如下：实施例1S1、取人体胚胎干细胞接种在小鼠胚胎成纤维细胞培养层上，其中培养液成分为：85％DMEM培养基中加入15％KnockoutSerumReplacement、4ng/mLbFGF、1-1.5mmol谷氨酰胺、0.1-0.15mol/Lβ-巯基乙醇、1mmol/L非必需氨基酸、50μg/mL链霉素、50μg/mL青霉素；S2、培养基置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，37℃条件下加入1mg/ml胶原酶Ⅳ进行消化传代，接种于新的饲养层细胞上，传代比例1:5-6；S3、将S2中的胚胎干细胞继续培养5-6d后取上清液,离心去细胞碎片,上清液过0.22μm滤膜,过滤后接种于含15％FCS，0.9％甲基纤维素的IMDM液中，并加入30-50ng/mLSCF，置于六孔培养板上悬浮3-4d形成胚胎体；S4、用PBS液吹打所述胚胎体，离心沉淀后加入胰蛋白酶消化，并吹打成单个小细胞团，以lx105mL-1的细胞密度接种于骨髓基质细胞饲养层，并加入50ng/mLSCF，37℃，5％CO2培养箱中培养，每5-6d换液一次，培养20-22d形成造血干细胞；S5、将S4中培养形成的造血干细胞加入胰蛋白酶-EDTA消化，之后加入胎牛血清停止消化；将消化后的干细胞加入至脱核诱导培养基重悬细胞，接种于培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每6-8d换液一次，20d后得到定向分化的红细胞；其中，所述脱核诱导培养基为StemSpan无血清培养基为基础培养基中加入10-12U/mlEPO和40-50ng/mlIGF-1。实施例2S1、取人体胚胎干细胞接种在小鼠胚胎成纤维细胞培养层上，其中培养液成分为：85％DMEM培养基中加入15％KnockoutSerumReplacement、4ng/mLbFGF、1-1.5mmol谷氨酰胺、0.1-0.15mol/Lβ-巯基乙醇、1mmol/L非必需氨基酸、50μg/mL链霉素、50μg/mL青霉素；S2、培养基置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，37℃条件下加入1mg/ml胶原酶Ⅳ进行消化传代，接种于新的饲养层细胞上，传代比例1:5-6；S3、将S2中的胚胎干细胞继续培养5-6d后取上清液,离心去细胞碎片,上清液过0.22μm滤膜,过滤后接种于含15％FCS，0.9％甲基纤维素的IMDM液中，并加入30-50ng/mLSCF，置于六孔培养板上悬浮3-4d形成胚胎体；S4、用PBS液吹打所述胚胎体，离心沉淀后加入胰蛋白酶消化，并吹打成单个小细胞团，以lx105mL-1的细胞密度接种于骨髓基质细胞饲养层，并加入50ng/mLSCF，37℃，5％CO2培养箱中培养，每5-6d换液一次，培养20-22d形成造血干细胞；S5、将S4中培养形成的造血干细胞加入胰蛋白酶-EDTA消化，之后加入胎牛血清停止消化；将消化后的干细胞加入至脱核诱导培养基重悬细胞，接种于培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每6-8d换液一次，20d后得到定向分化的红细胞；其中，所述脱核诱导培养基为StemSpan无血清培养基为基础培养基中加入10-12U/mlEPO和40-50ng/mlIGF-1。实施例3S1、取人体胚胎干细胞接种在小鼠胚胎成纤维细胞培养层上，其中培养液成分为：85％DMEM培养基中加入15％KnockoutSerumReplacement、4ng/mLbFGF、1-1.5mmol谷氨酰胺、0.1-0.15mol/Lβ-巯基乙醇、1mmol/L非必需氨基酸、50μg/mL链霉素、50μg/mL青霉素；S2、培养基置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，37℃条件下加入1mg/ml胶原酶Ⅳ进行消化传代，接种于新的饲养层细胞上，传代比例1:5-6本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人工诱导多能干细胞分化为红细胞的方法，其特征在于，该方法具体步骤如下：S1、取胚胎干细胞接种在小鼠胚胎成纤维细胞培养层上；S2、胚胎干细胞的常规培养；S3、胚胎干细胞预诱导形成胚胎体；S4、胚胎干细胞定向分化形成造血干细胞；S5、将消化后的干细胞加入至脱核诱导培养基重悬细胞，接种于培养皿中，培养20d后得到定向分化的红细胞。

【技术特征摘要】
1.一种人工诱导多能干细胞分化为红细胞的方法，其特征在于，该方法具体步骤如下：S1、取胚胎干细胞接种在小鼠胚胎成纤维细胞培养层上；S2、胚胎干细胞的常规培养；S3、胚胎干细胞预诱导形成胚胎体；S4、胚胎干细胞定向分化形成造血干细胞；S5、将消化后的干细胞加入至脱核诱导培养基重悬细胞，接种于培养皿中，培养20d后得到定向分化的红细胞。2.根据权利要求1所述的一种人工诱导多能干细胞分化为红细胞的方法，其特征在于：所述S1中培养液成分为，85％DMEM培养基中加入15％KnockoutSerumReplacement、4ng/mLbFGF、1-1.5mmol谷氨酰胺、0.1-0.15mol/Lβ-巯基乙醇、1mmol/L非必需氨基酸、50μg/mL链霉素、50μg/mL青霉素。3.根据权利要求1所述的一种人工诱导多能干细胞分化为红细胞的方法，其特征在于：所述S2中的具体步骤为，将S1中的培养基置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，37℃条件下加入1mg/ml胶原酶Ⅳ进行消化传代...

【专利技术属性】
技术研发人员：张正亮，
申请(专利权)人：安徽惠恩生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34