外周血单个核细胞中祛除低密度粒细胞的方法技术

本发明专利技术涉及外周血单个核细胞中祛除低密度粒细胞的方法，本发明专利技术根据淋巴细胞是悬浮细胞，而低密度粒细胞更容易贴壁生长的特点，对分离的外周血单个核细胞在培养板中静置培养1小时，利用低密度粒细胞主动贴壁的特点将低密度粒细胞从外周血单个核细胞中除掉，解决了现有的祛除外周血单个核细胞中低密度粒细胞的方法无法快捷有效地将低密度粒细胞祛除，且过程复杂的问题，本发明专利技术工艺简单、易于操作、成本低。

Method for removing low density granulocytes in peripheral blood mononuclear cells

The invention relates to a method for removing peripheral blood mononuclear cells in the low density of leukocytes, the invention is based on lymphocyte cell suspension, and the low density of granulocyte easier characteristics of adherent growth, on the separation of peripheral blood mononuclear cells in culture plates in static culture for 1 hours, with low particle density characteristics the active cell adherent low density neutrophils from peripheral blood mononuclear cells in the removed, solves the existing methods of removing peripheral blood mononuclear cells of low density cells cannot effectively eliminate the low density of granulocyte, and the complex process, the invention has the advantages of simple process, easy operation and low cost.

【技术实现步骤摘要】
外周血单个核细胞中祛除低密度粒细胞的方法
本专利技术涉及祛除低密度粒细胞的方法
，特别涉及外周血单个核细胞中祛除低密度粒细胞的方法。
技术介绍
系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus,SLE)患者的外周血单个核细胞(Peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs)中存在一类不同于普通中性粒细胞的粒细胞，称为低密度粒细胞(low-densitygranulocytes,LDGs)。LDGs的细胞表面标记与成熟的自体或健康对照的中性粒细胞类似，高表达中性粒细胞表面标记CD15、CD10、CD11b、CD11c和CD16，但是它们的细胞核形态与中性粒细胞不同，为不成熟的细胞核表型。LDGs表现出前炎症细胞的特点，激活后会损伤内皮细胞，并大量分泌肿瘤坏死因子(Tumornecrosisfactor，TNF)、Ⅰ型和Ⅱ型干扰素(Interferon，IFN)等细胞因子。被病原微生物或细胞因子激活后，LDGs可以释放由dsDNA、组蛋白、蛋白酶类和抗菌肽等形成的中性粒细胞胞外网状陷阱(Neutrophilextracellulartraps，NETs)去诱捕并杀灭病原微生物。与同源的中性粒细胞和健康对照的中性粒细胞相比，LDGs表现出了更强的NETs形成能力，且更易形成NETs。NETs除了起防御作用外，对免疫系统也有调节作用。体外培养PBMCs做淋巴细胞相关研究时，其内所含的异常增多的LDGs可能会在短短几小时内大量形成NETs。而NETs对培养的T淋巴细胞有广泛的影响，可以使CD4+T细胞群集，使活化标记CD25和CD69上调，导致TCR相关的信号激酶ZAP70的磷酸化，并使CD4+T细胞的激活阈值下调。与发生NETs的中性粒细胞和树突状细胞的共培养，导致了T细胞的激活，并使IFN-γ和IL-17的分泌显著增加。可见在做PBMCs培养时，LDGs通过形成NETs对T细胞的影响不容忽视。除了昂贵且复杂的流式分选或磁珠分选，非常有必要发现一种简单易用的从PBMCs中祛除LDGs的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，针对上述的问题，提供外周血单个核细胞中祛除低密度粒细胞的方法。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：外周血单个核细胞中祛除低密度粒细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步，将分离的外周血单个核细胞重悬在未加胎牛血清的RPMI1640培养基中；第二步，吸取细胞浓度1×105/ml的培养基溶液，放入孔板中，所述的孔板，具体是96孔板或48孔板或24孔板或12孔板或6孔板，选取96孔板时，每孔加入100ul，选取48孔板时，每孔加入300ul，选取24孔板时，每孔加入0.6ml，选取12孔板时，每孔加入1.5ml，选6孔板时，每孔加入3ml；第三步，将孔板放入浓度为5％的CO2细胞培养箱中静置培养1小时；第四步，吸取上清液加入到离心管中，并加入两倍体积的磷酸缓冲盐溶液，放入离心机中离心10分钟；第五步，去除上清液后用RPMI1640培养基重悬外周血单个核细胞备用。本专利技术的有益效果是，解决了从PBMCs中祛除LDGs的技术难题。由于自身免疫病中PBMCs中LDGs普遍异常升高，而且PBMCs中所含的LDGs会严重影响T细胞的功能，所以在以T细胞为研究对象的研究中，需要祛除PBMCs中的LDGs。目前从PBMCs中祛除LDGs的方法有磁珠分选和流式分选。这两种方法利用磁珠标记或荧光标记的单克隆抗体分别与目标细胞受体进行特异性结合而获得特定细胞株，分为阳性选择和阴性选择。阳性选择获得的T细胞，由于结合了特异性抗体，可能会影响细胞的某些功能。而阴性选择时需要使用多种抗体去结合非目的细胞而保留T细胞，所以分选成本比很高。这两种分选方法费时费力，分选成本很高，完全不适合临床应用。本专利技术所述方法解决了这一难题，从PBMCs中祛除LDGs省时省力，不增加额外费用，适合临床及科研应用。附图说明图1是本专利技术的关于LDGs在自身免疫病中普遍异常升高的统计示意图。图2是本专利技术的关于离心力对清除PBMCs中LDGs影响的统计图。图3是本专利技术的清除PBMCs中LDGs优于先沉淀后离心的统计图。图4是本专利技术的LDGs清除率优于其他方法的统计图。图5是本专利技术的祛除LDGs后对PBMCs中T细胞比例无明显影响的统计图。图6是本专利技术的祛除LDGs后对PBMCs中T细胞比例几乎无影响的统计图。具体实施方式外周血单个核细胞中祛除低密度粒细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步，将分离的外周血单个核细胞重悬在未加胎牛血清的RPMI1640培养基中；第二步，吸取细胞浓度1×105/ml的培养基溶液，放入孔板中，所述的孔板，具体是96孔板或48孔板或24孔板或12孔板或6孔板，选取96孔板时，每孔加入100ul，选取48孔板时，每孔加入300ul，选取24孔板时，每孔加入0.6ml，选取12孔板时，每孔加入1.5ml，选6孔板时，每孔加入3ml；第三步，将孔板放入浓度为5％的CO2细胞培养箱中静置培养1小时；第四步，吸取上清液加入到离心管中，并加入两倍体积的磷酸缓冲盐溶液，放入离心机中离心10分钟；第五步，去除上清液后用RPMI1640培养基重悬外周血单个核细胞备用。本专利技术在实际临床试验中，以2012年11月到2014年4月期间在中日友好医院住院治疗患者作为临床对象，其中55例皮肌炎(Dermatomyositis,DM)患者和15例多发性肌炎(Polymyositis,PM)患者满足B/P诊断标准作为DM组和PM组，42例类风湿关节炎(Rheumatoidarthritis,RA)患者满足2010RA分类标准作为RA组，25例SLE患者满足1997ACR关于SLE分类标准作为SLE组。19例性别和年龄匹配的健康志愿者作为对照组，各组基本资料见表1。表1.研究人群的基本信息1.PBMCs的分离采用EDTA抗凝管抽取10ml健康对照和患者的全血，在6小时内采用密度梯度离心法分离PBMCs。具体步骤为：①将4ml的Histopaque-1077分离液加入15ml离心管，其上小心加入5ml到8ml全血；②采用水平离心机400×g离心30分钟；③最上层为血浆，其下依次为PBMCs和红细胞沉淀层，小心从上吸取血浆，分装后冻存在-80℃备用；④用1ml移液器轻柔吸取PBMCs云雾层，将PBMCs加入新的15ml离心管，加入磷酸盐缓冲液10ml轻柔吹打洗涤细胞；⑤300×g离心10分钟，若PBMCs中混有较多红细胞可用低渗盐水溶红；⑥用0.2％的低渗盐水溶红30秒，再加入1.6％的高渗盐水平衡渗透压(选用步骤)；⑦用磷酸盐缓冲液再洗1次后，将PBMCs重悬入磷酸盐缓冲液中，血细胞计数板计数后，根据需要的细胞数计算细胞悬液量；⑧每例取1×106细胞用于流式测定LDGs；2.LDGs的测定PBMCs中LDGs的测定采用流式细胞术。单核细胞高表达CD14，低表达或不表达CD15；而LDGs高表达CD15，低表达或不表达CD14。采用FITC-标记的抗CD15抗体(Biolegend)和PE标记的抗CD14抗体(Biolegend)，可以容易的区分出LDGs本文档来自技高网...

【技术保护点】
外周血单个核细胞中祛除低密度粒细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步，将分离的外周血单个核细胞重悬在未加胎牛血清的RPMI 1640培养基中；第二步，吸取细胞浓度1×10

【技术特征摘要】
1.外周血单个核细胞中祛除低密度粒细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步，将分离的外周血单个核细胞重悬在未加胎牛血清的RPMI1640培养基中；第二步，吸取细胞浓度1×105/ml的培养基溶液，放入孔板中，所述的孔板，具体是96孔板或48孔板或24孔板或12孔板或6孔板，选取96孔板时，每孔加入100ul，选取48孔板时，每孔加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：张思功，
申请(专利权)人：兰州大学第二医院，张思功，
类型：发明
国别省市：甘肃,62