The invention discloses a method for separating, identifying and inducing the differentiation of bone marrow mononuclear cells, which comprises the steps of isolation, identification and induced differentiation of bone marrow mononuclear cells. The invention adopts the bone marrow mononuclear cells as the research object, with the osteoclast precursor cell line is more persuasive; the method of the invention overcomes the shortcomings of traditional syringe flushing the bone marrow cavity method, greatly shorten the time for bone marrow mononuclear cells, increase cell activity; bone marrow mononuclear cells isolated by the method the invention can be successfully induced to differentiate into osteoclasts; the method of the invention from the number of mononuclear cells purified from bone marrow, considerable stable and high activity, can provide a reliable basis for the study of cell source for bone metabolic disease in the future.
【技术实现步骤摘要】
一种骨髓单核细胞分离、鉴定及诱导分化的方法
本专利技术属于细胞生物学领域,涉及细胞的分离、鉴定及分化领域,具体为一种骨髓单核细胞分离、鉴定及诱导分化的方法。
技术介绍
随着老龄化社会的到来,骨质疏松症已成为危害老龄人口健康的第四大因素。作为一种系统性骨病,骨质疏松的临床表现主要为骨量下降、骨微结构退化、骨脆性增加等。可引起全身关节酸痛,腰背疼痛甚至骨折,大大降低了患者的生活质量,同时也给家庭、社会带来巨大压力。如何预防和延迟骨质疏松的发生已经成为当下重要的健康课题。骨质疏松的发生在病理上与破骨细胞有着密切的关系,如何成功获得破骨细胞是进一步研究骨质疏松症的关键。目前,破骨细胞的获取方法主要分为机械分离法和诱导法。由于破骨细胞是一种高代谢终末分化细胞,具有无法传代、存活时间短等特点,且破骨细胞在体内数量极少,因此机械分离获取困难。在现有的诱导方法中,通过RAW264.7细胞系诱导是目前最常用的诱导方法,然而,由于RAW264.7是细胞系,与原代细胞基因系存在的具体差异无法知晓。骨髓单核细胞作为一种较为前体的破骨细胞,采用其作为研究对象更有说服力。另外,通过骨髓单核细胞诱导获得的破骨细胞在数量、纯度、成熟度等方面均优于脾细胞诱导法和外周血单核细胞诱导法获得的破骨细胞。关于骨髓单核细胞诱导获得破骨细胞的方法国内外文献报道较少,主要原因是采用骨髓单核细胞作为研究对象需要进行原代提取,而原代提取需要精细剥离长骨周围软组织,需要大量的精力和时间。这不仅降低了研究人员的积极性,而且常导致提取的原代细胞活性较低,诱导分化效果较差。因此,建立一种简便快速的体外分离、扩增骨髓 ...
【技术保护点】
一种骨髓单核细胞分离、鉴定及诱导分化的方法,其特征在于,包括以下步骤:第1步、骨髓单核细胞分离a、取移液枪枪头,剪取其下端1~1.5cm的移液口,采用尖头镊子将移液口进行扩口处理;b、取1.5mL规格的EP管,将步骤a中的移液口置于EP管中,组装后灭菌;c、无菌条件下分离完整的大鼠胫骨、股骨,将其剪断后断端朝下,置于步骤b中灭菌处理后的移液口中,6000r/min×30s离心1次;第2步、骨髓单核细胞鉴定d、将第1步分离的骨髓单核细胞接种至含25~100ng/mL M‑CSF的完全培养基中培养,隔天半量换液,观察细胞形态学特征;e、培养3~5天后,取步骤d培养的细胞,采用流式细胞术检测其表面抗原CD11b的阳性表达率;f、取步骤d培养了1~9天的细胞,采用CCK‑8法绘制生长曲线;第3步、骨髓单核细胞诱导分化g、取步骤d培养的细胞,采用M‑CSF和RANKL诱导其分化,并通过TRAP染色、CTR荧光染色鉴定为成熟破骨细胞。
【技术特征摘要】
1.一种骨髓单核细胞分离、鉴定及诱导分化的方法,其特征在于,包括以下步骤:第1步、骨髓单核细胞分离a、取移液枪枪头,剪取其下端1~1.5cm的移液口,采用尖头镊子将移液口进行扩口处理;b、取1.5mL规格的EP管,将步骤a中的移液口置于EP管中,组装后灭菌;c、无菌条件下分离完整的大鼠胫骨、股骨,将其剪断后断端朝下,置于步骤b中灭菌处理后的移液口中,6000r/min×30s离心1次;第2步、骨髓单核细胞鉴定d、将第1步分离的骨髓单核细胞接种至含25~100ng/mLM-CSF的完全培养基中培养,隔天半量换液,观察细胞形态学特征;e、培养3~5天后,取步骤d培养的细胞,采用流式细胞术检测其表面抗原CD11b的阳性表达率;f、取步骤d培养了1~9天的细胞,采用CCK-8法绘制生长曲线;第3步、骨髓单核细胞诱导分化g、取步骤d培养的细胞,采用M-CSF和RANKL诱导其分化,并通过TRA...
【专利技术属性】
技术研发人员:马勇,王礼宁,郭杨,郑苏阳,潘娅岚,司誉豪,孙杰,
申请(专利权)人:南京中医药大学,
类型:发明
国别省市:江苏,32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。