白细胞或单核细胞的分离方法、分离材技术

本发明专利技术的课题是提供从含有各血细胞成分的体液有效率地分离白细胞或单核细胞的分离系统和分离材。通过使含有各血细胞成分的体液与平均纤维直径为2.0μm～6.0μm且透气性系数M为6.2～35以下的分离材接触而将白细胞捕集到分离材，使用剥离溶液回收被捕集的白细胞或单核细胞，从而能够更有效率地分离白细胞或单核细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于从含有各血细胞成分的体液选择性地回收白细胞或单核细胞的分离材、分离方法。
技术介绍
近年来，伴随着血液学、科学技术的迅速进步，如下治疗方式得到广泛普及，S卩，通过从以全血、骨髓、脐带血、组织提取物为代表的体液仅分离需要的血液组分并供患者使用来提高治疗效果，进而，通过不给予治疗所不需要的部分来抑制副作用。例如，血液输血也是其中之一。红细胞制剂是在出血和红细胞不足的情况下、或在由于红细胞的功能降低而导致氧缺乏的情况下得到使用的血液制剂。红细胞制剂中不需要会诱导异常的免疫反应、移植物抗宿主病(GVHD)等副作用的白细胞，需要用过滤器除去白细胞。根据情况，有时除白细胞之外，也要除去血小板。另一方面，血小板制剂是由存在血液凝固因子的缺乏而导致的出血或有出血趋势的患者所使用的血液制剂。为了制造血小板制剂，通过离心分离来除去血小板以外的不需要的细胞、成分，仅采集需要的血小板成分。而且，近年来，开始积极进行面向白血病、实体癌治疗的造血干细胞移植，可采取将治疗所需要的含有造血干细胞的白细胞群分离并给予的方法。作为该造血干细胞的来源，从供体的负担少、增殖能力优异等优点出发，除骨髓、外周血之外，脐带血也备受关注。另外，近年来，启示了在月经血中也存在丰富的干细胞，存在此前被废弃的月经血也可作为珍贵的干细胞来源而被利用的可能性。对于骨髓、外周血 ，期望除去不需要的细胞，将白细胞分离、纯化后给予，另一方面，对于脐带血，用于血缘者的血液银行开始盛行，需要冷冻保存至使用时，所以出于防止由冷冻保存而导致的红细胞溶血的目的，也要将白细胞分离、纯化。作为白细胞的分离方法，提出了利用使用了聚蔗糖(Ficoll)的比重液进行的离心分离法、使用了作为红细胞沉降剂的羟乙基淀粉的离心分离法，但存在无法进行封闭体系内的处理而混入异物、菌，处理需要长时间等问题。作为不使用离心分离法的细胞分离方法，最近还报告了使用不捕集红细胞和血小板而仅捕集白细胞的过滤材料来回收白细胞的方法(专利文献1、专利文献2)。然而，以往，报告了为了将白细胞捕集到过滤器，纤维直径需要小于3 μ m(非专利文献I )，在各文献的报告中使用的分离材的纤维直径也小于2.5 μ m (专利文献1、专利文献2、专利文献3)。这是由于以往的白细胞除去过滤器以最大限度地除去白细胞为目的，白细胞的捕集率高，另一方面，存在进行体液处理时容易堵塞，回收操作时引起压力上升而诱发细胞回收率的降低、工艺问题等问题。因此，作为用于回收白细胞的过滤器，即使转用以往的白细胞除去过滤器，也无法实现充分的功能。专利文献1:日本特表2001-518792号公报专利文献2:国际公开第98/32840号公报专利文献3:日本特开平10-313855号公报非专利文献1:纤维学会志 Vol.61，N0.8ρ.Ρ215-216 (2005)
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于从含有各血细胞成分的体液在避免压力上升的同时，以高效率回收白细胞或单核细胞的分离材，以及使用了该分离材的细胞分离方法。本专利技术人等对能够有效率地从体液分离白细胞或单核细胞且不易引起压力上升的分离材、细胞分离方法进行了深入研究。其结果发现通过使用特定的分离材，能够有效率地分离白细胞或单核细胞，从而完成了本专利技术。即，本专利技术涉及一种用于从体液分离白细胞或单核细胞的分离材，其特征在于，由平均纤维直径为2.Ομπι 6.Ομπι且透气性系数M为6.2 35的无纺布构成。无纺布优选由选自聚烯烃、聚酰胺以及聚酯中的至少I种构成。体液优选为选自外周血、脐带血、骨髓、月经血以及组织提取物中的至少I种。另外，本专利技术涉及一种细胞分离用容器，其是由将上述分离材填充于具有体液的入口和体液的出口的容器而得到的。在细胞分离用容器中，优选将分离材在体液的流动方向上填充有I片分离材或者以层叠的方式填充有多片分离材，并优选在体液的流动方向上以被压缩的状态进行填充。细胞分离用容器优选为柱型。另外，本专利技术涉及一种细胞分离方法，其包括使体液与上述分离材接触而分离白细胞或单核细胞的工序。另外，本专利技术涉及白细胞或单核细胞的细胞分离方法，其包括使体液与上述细胞分离用容器接触而将白细胞或单 核细胞捕集到分离材的第一工序；和使用剥离溶液从分离材回收白细胞或单核细胞的第二工序。在该细胞分离方法中，优选第一工序为从上述细胞分离用容器的入口导入体液并从出口排出的工序，优选第二工序为从细胞分离用容器的出口导入剥离溶液并从入口回收白细胞或单核细胞的工序。进一步优选在第一工序之后并在第二工序之前，包括通过从入口导入生理盐水或缓冲液来除去细胞分离用容器内的夹杂成分的工序。进一步优选在第一工序之前，包括使分离材与生理盐水或缓冲液接触的工序。进一步优选在第一工序之前，包括将细胞分离容器的体液的入口固定在低于细胞分离容器的体液的出口的高度的工序。优选白细胞和血小板实质上被分离材捕集而红细胞实质上不被捕集。优选被分离的白细胞或单核细胞包含造血干细胞和/或间充质干细胞。另外，本专利技术涉及一种冷冻保存方法，其特征在于，将利用上述细胞分离方法得到的细胞置于液氮环境下。液氮环境下优选为_196°C -30°C。在该冷冻保存方法中，优选使用选自二甲基亚砜、右旋糖酐、白蛋白以及羟乙基淀粉中的至少I种冷冻保护剂。优选冷冻保存过的干细胞的成活率为80%以上。另外，本专利技术涉及白细胞、单核细胞或干细胞，它们是利用上述细胞分离方法得到的。干细胞优选包含选自⑶34阳性细胞、⑶133阳性细胞、⑶34阴性且⑶133阳性细胞、⑶34阳性且⑶133阳性细胞、⑶34阳性且⑶133阴性细胞、⑶45阴性且⑶44阳性且⑶73阳性且⑶90阳性细胞、⑶45阴性且⑶235a阴性且⑶33阴性且⑶7阴性细胞、⑶45阳性且⑶133阳性且CDl 17阳性细胞、CD45阳性且CD 133阴性且CDl 17阳性细胞、CD45阳性且CD 133阳性且CD 164阳性细胞、CD45阳性且CD 133阴性且CD 164阳性细胞、以及CD45阴性且⑶309阳性细胞中的任一细胞。白细胞优选包含⑶45阳性且⑶164阳性细胞、或⑶45阳性且⑶117阳性细胞。根据本专利技术，能够从以全血、骨髓、脐带血、月经血、组织提取物为代表的体液，简便且迅速地在不易引起堵塞、压力上升的情况下有效率地分离白细胞或单核细胞。如果使用本专利技术的分离材和细胞分离方法，则与以往报告的方案相比，具有不易引起堵塞，而且白细胞、单核细胞的回收率高的多方面的优点。进而，该技术也可以在形成白细胞层(buffy coat)等前处理后使用，但在基本上不进行这样的前处理的情况下也能够从外周血、脐带血、骨髓、月经血、组织提取物分离白细胞或单核细胞。将本专利技术的分离材填充于容器而得到的过滤器也能够在用无菌封闭体系进行的处理中使用。被回收的含白细胞的液体或含单核细胞的液体是含有丰富的造血干细胞、间充质干细胞的细胞群，能够作为用于白血病治疗、心肌再生、血管再生等再生医疗的治疗细胞制备用过滤器而提供。就使用本专利技术的分离材而得到的白细胞而言，红细胞的混入率极低，即使冷冻保存至使用时，由溶血等引起的影响也非常少。另外，白细胞被无菌分离，所以也能够直接扩增来制备细胞。因此，本发·明的分离材除输血用制剂制备用途之外，作为用于制备再生医疗用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：佐藤伸彦，塚本彩子，
申请(专利权)人：株式会社钟化，
类型：
国别省市：